【摘 要】
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背景:内皮细胞焦亡与动脉粥样硬化形成密切相关,抑制内皮细胞焦亡是治疗动脉粥样硬化的有效策略。琥珀酸是具有代谢和免疫调节的双重功能的代谢产物,本课题组前期研究表明琥珀酸盐具有促进apo E-/-小鼠动脉粥样硬化病变的作用,然而琥珀酸驱动动脉粥样硬化的作用与内皮细胞焦亡具体机制尚不清楚。在本文中,我们将深入探讨琥珀酸对内皮细胞焦亡的影响及其对线粒体损伤的调控机制。目的:探讨琥珀酸是否以及如何影响内皮细
【基金项目】
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湖南省技术创新引导计划-临床医疗技术创新引导项目（2018SK51603）； 湖南省卫健委项目（B2019122）； 湖南省卫健委重点指导课题（20201920）； 湖南省科技创新重点工程项目（2020SK1013-2）； 湖南创新型省份建设专项经费（2020SK
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背景:内皮细胞焦亡与动脉粥样硬化形成密切相关,抑制内皮细胞焦亡是治疗动脉粥样硬化的有效策略。琥珀酸是具有代谢和免疫调节的双重功能的代谢产物,本课题组前期研究表明琥珀酸盐具有促进apo E-/-小鼠动脉粥样硬化病变的作用,然而琥珀酸驱动动脉粥样硬化的作用与内皮细胞焦亡具体机制尚不清楚。在本文中,我们将深入探讨琥珀酸对内皮细胞焦亡的影响及其对线粒体损伤的调控机制。目的:探讨琥珀酸是否以及如何影响内皮细胞焦亡及其具体作用机制方法:1.丙二酸二乙酯处理人脐静脉内皮细胞构建琥珀酸蓄积模型;2.ATP5F1D沉默病毒及过表达病毒转染人脐静脉内皮细胞;3.ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中炎症因子白介素-1β（IL-1β）、白介素-18（IL-18）的含量;4.蛋白免疫印迹检测琥珀酸对人脐静脉内皮细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、pro-Caspase-1、Caspase-1的表达;5.电镜观察焦亡小体、膜孔隙的改变;6.对琥珀酸处理的内皮细胞进行RNA-seq测序寻找琥珀酸调控线粒体功能的靶基因;7.流式细胞术检测线粒体膜电位的变化;8.线粒体活性氧检测试剂盒检测活性氧的改变;9.采用ATP含量试剂盒检测细胞ATP含量;10.透射电子显微镜观察琥珀酸对线粒体形态及数量的改变。结果:1.琥珀酸促进人脐静脉内皮细胞线粒体损伤和焦亡（1）Western blot结果提示琥珀酸蓄积能明显上调内皮细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、pro-Caspase-1、Caspase-1的表达（P＜0.05）（2）ELISA结果表明琥珀酸蓄积导致内皮细胞上清液炎症因子IL-18、IL1β的分泌增加;（3）扫描电镜结果表明琥珀酸蓄积诱导膜孔隙形成;（4）流式细胞术结果表明琥珀酸不影响线粒体膜电位,ATP含量试剂盒结果表明琥珀酸抑制血管内皮细胞ATP生成,荧光探针结果表明线粒体活性氧含量增加;（5）透射电镜表明琥珀酸处理组内皮细胞线粒体肿胀并空泡化;2.ATP5F1D是琥珀酸的下游靶点,其下调诱导内皮细胞焦亡（1）RNA测序结果提示ATP5F1D是琥珀酸的下游靶点,Western blot及RT-PCR结果证实琥珀酸蓄积导致内皮细胞ATP5F1D下调（P＜0.05）;（2）Western blot结果表明敲减ATP5F1D能明显上调细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、pro-Caspase-1、Caspase-1的表达（P＜0.05）;（3）ELISA结果表明琥珀酸蓄积导致炎症因子IL-18、IL1β的分泌增加（P＜0.05）;（4）扫描电镜结果表明ATP5F1D抑制血管内皮细胞膜孔隙形成,抑制血管内皮细胞焦亡;3.琥珀酸通过下调ATP5F1D诱导内皮细胞线粒体功能障碍和焦亡（1）Western blot结果表明敲减ATP5F1D后逆转琥珀酸介导的焦亡相关蛋白（NLRP3、pro-Caspase–1、GSDMD、Caspase-1）表达上调（P＜0.05）;（2）ELISA结果表明回补ATP5F1D后减少琥珀酸介导的IL-18、IL-1β的分泌（P＜0.05）;（3）线粒体活性氧检测结果表明重新上调ATP5F1D后减轻琥珀酸诱导的活性氧增加（P＜0.05）。结论:琥珀酸通过下调ATP5F1D损伤线粒体功能,促进HUVECs焦亡。
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