论文部分内容阅读
糖尿病(diabetesmellitus)是胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低所引起的代谢紊乱，临床以高血糖、高血脂、高粘血症为主要标志的全身慢性代谢性临床综合征。近年来，糖尿病本身及其并发症对人们的身心健康危害重大，已经成为现代流行疾病的第二杀手，仅次于癌症对人类的危害。因此，寻找更好的糖尿病药物和治疗方法是人们致力攻克的一大难题。
胰高血糖素样肽-1(glueagon-likepeptide-1，GLP-1）又称促胰岛素，它是一种通过与胰岛β细胞表面的特异受体相互作用而使葡萄糖诱导的胰岛素分泌显著增强的短肽。GLP-1还能减少胰岛细胞损伤，改善胰岛细胞结构，修复胰岛β细胞功能，抑制β细胞调亡，提高胰岛细胞活力并延长其寿命，抑制胰升糖素的释放，调控胰腺β细胞特异基因表达并通过这种基因调控改善葡萄糖转运和代谢，提高β细胞对葡萄糖的反应性以及降低食欲和抑制胃的排空等功能。GLP-1被认为是一种从根本上治疗糖尿病的“治标治本”多功效的多肽类激素，对糖尿病的治疗具有重要意义。
植物是最经济的生物反应器，允许表达产物蛋白亚细胞定位，正确折叠和转录后修饰。目前，利用转基因植物已经生产了许多药用重组蛋白和肽类。黄瓜脆嫩味美，含糖量低，是糖尿病人理想的蔬菜及水果之一。
尽管天然GLP-I对糖尿病具有很好的疗效，但由于体内二肽基肽酶-IV(DPP-IV)的快速降解和肾脏代谢作用，导致其半衰期很短（2～5min），成为限制其临床应用的主要瓶颈。因而，研发长效药用GLP-1类似肽已成为学术界关注的一个热点。本研究的目的是通过基因工程技术构建高效表达长效laGLP-1(long-actingGLP-1)、获得对糖尿病具有预防和治疗效果的转基因黄瓜，使患者在食用美味黄瓜的同时对糖尿病起到预防和治疗作用。为此，本研究使用了在生物活性高且消除了二肽酶IV(DPPIV)位点和胰蛋白识别位点的laGLP-1基因，其表达产物可用于口服或食用。并且，为实现IaGLP-1的高效表达，本研究首次构建了含十拷贝IaGLP-1串联重复融合基因的表达载体pX6-GLP-T。通过农杆菌介导法、花粉管通道法和floraldip法对黄瓜自交系2M1进行转化。获得的转基因黄瓜表达的多拷贝1aGLP-1融合蛋白食用后可被胃肠道内的胰蛋白酶切割释放有效IaGLP-1单体，发挥其促进胰岛素分泌和胰岛修复功能，达到预防和治疗糖尿病的作用，减轻糖尿病本身和打针吃药给患者带来的痛苦.
本研究选用无抗生素选择性标记基因(marker-free)的植物表达载体px6，获得的转基因苗通过诱导重组剔除抗生素选择性标记基因，从而获得稳定可靠、食用安全的转基因黄瓜，保证其环境释放和食用的安全性。
在对黄瓜遗传转化过程中，通过对苗龄、生长激素种类及浓度等影响器官发生的因素进行研究，优化了影响黄瓜子叶节经器官发生途径诱导丛生芽形成的重要因素，建立了高效、稳定的黄瓜离体体细胞再生体系：以培养3-4天的无菌苗子叶节为外植体，以MS为基本培养基为诱导培养基，附加BA2.0mg/L，NAA0.5mg/L，ABA10mg/L，蔗糖60g/L，琼脂7g/L。采用该体系外植体出芽率较高，可应用于农杆菌介导的遗传转化．对农杆菌介导的遗传转化体系进行优化研究结果表明，农杆菌侵染15min，共培养2天，采用前7天卡那霉素延迟筛选方法出芽率最高．
本研究还采用农杆菌介导、花粉管通道和floraldip等多种遗传转化方法对黄瓜自交系2MI进行了转化。经PCR及Southern杂交检测，共获得12株含有多拷贝laGLP-I基因的转基因黄瓜植株．其中，农杆菌侵染的转化率为0.2％，花粉管通道法的转化率为0.09%，floraldip法的转化率为0.52%。将获得的转基因植株经过β-雌二醇的诱导后，得到了marker-free转基因黄瓜植株．进行Westernblot分析，有2株植株呈阳性结果，分别命名为A1033，A1065。通过对A1065株系的后代进行分析，获得5株成功表达多拷贝laGLP-1基因的后代。
以AI065植株为材料，将黄瓜果实粉碎，提取总蛋白，以其浓缩物溶解液灌喂高血糖Wistar大鼠。结果表明，两个处理组口服多拷贝IaGLP-120天后，高血糖大鼠的血糖值均显著下降，从24.5+-2.5mM降低到13.2+-3.3mM，而正常对照组和0.9%NaCl对照组的血糖值在实验前后均无显著变化．表明通过给高血糖大鼠灌服多拷贝laGLP-1蛋白后，融合蛋白在胃肠道中可被胰蛋白酶降解为IaGLP-I单体，进入血液循环进而降低了高血糖大鼠的血糖水平。同时也改善了模型大鼠的饮食、饮水平衡。
本研究还利用构建的植物病毒表达载体p35S-30B-GLP-T，采用叶片农杆菌注射侵染法和根部吸收法两种简单、快捷的瞬时表达技术体系，在烟草中瞬时表达了多拷贝laGLP-1蛋白，并对瞬时表达外源蛋白的体系进行了优化，结果表明当菌液重悬液MMAOD600=l.0时，多拷贝laGLP-1的表达效率较高，其表达量占总可溶性蛋白的0.4%左右。证明这种植物高效瞬时表达体系可能对采用植物生物反应器直接生产多肽类药物具有重要意义。