论文部分内容阅读
肠道共生菌群可以促进肠道内环境的平衡，调节宿主的免疫系统，增强肠道粘膜的屏障功能和肠上皮细胞的代谢活性。病原微生物的入侵会导致肠道微生态系统的紊乱，破坏肠道菌群之间的平衡。而典型的抗生素治疗不仅会导致细菌的耐药性问题，也会杀死共生菌群，具有显著的后遗症。新一代的基因编辑技术CRISPR/Cas系统可以特异性的识别细菌基因组，剪切DNA双链，从而引起细菌程序性凋亡。本论文以Escherichia coli Nissle1917、E.coli BL21 DE3 pLysS和Salmonella enterica ATCC14028为研究对象，通过建立穿梭型CRISPR/Cas9系统以接合转移的方式转入目的菌株，从而实现特异性清除病原菌的目的。 本论文针对菌株Nissle1917基因组中的clbI、clbP、lacZ、gyrA和gyrB基因设计介导RNA(gRNA)，对BL21 DE3 pLysS基因组中的lacI、lacZ、T7 RNAP、gyrA和gyrB基因设计gRNA，对S.enterica ATCC14028ATCC14028的gyrA、gyrB、sigD、sigE和sodC基因设计gRNA，并构建广宿主载体pBBR1-Cas9，分别测试CRISPR/Cas9系统在E.coli Nissle1917、E.coli BL21 DE3 pLysS和S.enterica ATCC14028三株菌内的DNA剪切功能。结果显示质粒pBBR1-Cas9经电转化分别导入E.coli Nissle1917、E.coli BL21 DE3 pLysS和S.enterica ATCC14028后，致死率达99.999％，实验证明CRISPR/Cas9系统具有清除病原菌的高效性。 在此基础上，构建了穿梭型CRISPR/Cas9系统E.coli S17-1λpir/pRTC-Cas9，通过接合转移的方式清除目标菌株。为了便于监测菌群变化，对供体菌E.coliS17-1λpir进行GFP标记，对受体菌E.coli Nissle1917进行RFP标记。对于BL21DE3 pLysS和S.enterica ATCC14028分别用氯霉素和氨苄进行筛选计数。进一步利用荧光显微镜观察供体菌E.coliS17-1λpir与受体菌E.coli Nissle1917混合之后的动态变化。将含有pRTC-Cas9质粒的供体菌与受体菌以不同比例混合进行接合转移，菌落计数发现CRISPR系统可以将E.coli Nissle1917细菌降低到为2.8％，BL21 DE3 pLysS降低为1.9％，S.enterica降低为2.1％。荧光显微镜观察发现菌株E.coli Nissle1917与供体菌接合4h时后显著减少，随后下降趋势减弱。 本研究利用电转化和接合转移的方式测试CRISPR/Cas9系统对病原菌的定向清除效率，研究发现，利用CRISPR系统可以高效、特异的杀灭病原菌，但不影响其它非靶向微生物。