论文部分内容阅读
目的:本研究旨在利用基因工程技术构建的大鼠β-防御素-2(rBD-2)基因真核表达载体,通过过表达慢病毒包装转染大鼠角膜上皮细胞后,评价基因重组rBD-2在体外转染细胞中的表达及抗菌活性,并构建大鼠真菌性角膜感染模型,研究重组rBD-2对抗真菌感染的保护作用,以期为进一步研究人类β-防御素-2基因治疗真菌性角膜炎提供依据。方法:通过基因工程技术构建的大鼠β-防御素-2基因真核表达载体,将目的基因rBD-2慢病毒表达载体与包装质粒共转293T细胞,进行目的基因的慢病毒包装,体外转染大鼠角膜上皮细胞株。在倒置显微镜下观察细胞转染情况,采用RT-PCR及Western blotting检测细胞中rBD-2基因在mRNA及蛋白水平的表达,再经实时荧光定量RT-PCR相对定量法检测转染细胞中rBD-2基因mRNA的表达。最后建立真菌(烟曲霉菌)性角膜炎大鼠动物模型,分为对照组与实验组。实验组给予携带rBD-2基因的RSB-S16111411/rBD-2过表达慢病毒包装细胞株混悬液滴眼;对照组予以空载体转染阳性细胞株混悬液滴眼,均为每天4次,每次一滴。滴眼开始后3、6、9、12、15天分别通过裂隙灯显微镜对比观察大体、临床评分,行角膜组织真菌培养,了解角膜炎症反应程度差异。结果:1.所构建的pHS-GS034-rBD-2真核重组质粒,在BamHI酶与NheI酶双酶切后电泳及测序鉴定,插入的核苷酸序列为目标基因rBD-2,证明成功构建重组载体。2.倒置荧光显微镜下可见病毒包装重组质粒RSB-S16111411/rBD-2转染的大鼠角膜上皮细胞和病毒感染的大鼠角膜上皮细胞中有绿色荧光发出,未转染的空细胞组无荧光。3.应用qPCR定量法检测到过表达病毒包装的重组质粒RSB-S16111411/rBD-2转染组的大鼠角膜上皮细胞中rBD-2基因的mRNA表达水平明显多于另两组。4.采用角膜划痕法建立大鼠真菌性角膜炎模型,通过临床表现、角膜刮片和培养证实该疾病模型成功建立。5.以细胞株悬液滴治大鼠角膜,可通过临床表现、真菌性角膜炎评分以及角膜刮片观察到,含rBD-2的过表达慢病毒包装质粒对真菌性角膜炎有一定疗效。结论:应用基因工程技术构建的rBD-2真核表达载体行过表达慢病毒包装为重组质粒RSB-S16111411/rBD-2,转染大鼠角膜上皮细胞,能够使外源rBD-2基因在大鼠角膜上皮细胞中被转录成mRNA。利用此细胞株混悬液滴眼,对大鼠真菌性角膜炎具有一定疗效。