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微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,能够感染从无脊椎动物到脊椎动物在内的几乎所有动物,包括重要的经济昆虫蜜蜂、家蚕甚至免疫缺陷的病人。微孢子虫的生活史与宿主紧密联系,一般分为三个阶段:感染期、裂殖增殖期和孢子形成期,其中裂殖增殖期既是细胞内发育的起始时期,也是微孢子虫在宿主细胞中快速增殖、传播的关键阶段。因此截断或限制家蚕微粒子虫的裂殖增殖是微孢子虫防控的重要策略。Septin是一类高度保守的GTP结合蛋白,广泛存在于酵母、线虫和哺乳动物等除植物以外的真核生物中。在其他真菌中的研究表明,Septin可以通过形成细胞骨架结构和招募蛋白等方式参与细胞分裂这一重要生物学过程。因此,我们以Septin的研究为切入点开展微孢子虫裂殖增殖的相关研究,以期更加深入的了解微孢子虫裂殖增殖形式和周期。本研究以酿酒酵母的Septins序列为模板,筛选家蚕微粒子虫基因组数据库,获得家蚕微粒子虫的3个Septin基因,通过序列分析、保守性分析、转录特征分析、亚细胞定位特征分析和互作分析等对家蚕微粒子虫的Septins进行鉴定,并分析其在裂殖增殖期的作用。主要研究内容如下:1.家蚕微粒子虫Septins蛋白的鉴定及转录特征分析本研究利用生物信息学方法,基于家蚕微粒子虫CQI株基因组数据进行全基因组保守结构域分析以及利用酿酒酵母的7个Septin序列为模板,在家蚕微粒子虫CQI株基因组中筛选到了三个septin基因,分别命名为NbSeptin1(GenBank NO:AGT97394.1,NbSPT1)、NbSeptin2(GenBank NO:EOB13962.1,NbSPT2)和NbSeptin3(GenBank NO:AHN50233.1,NbSPT3)。氨基酸序列分析显示,NbSPT1预测分子质量为35.02 kDa,理论等电点pI 5.49。NbSPT2预测分子质量为37.28 kDa,理论等电点pI 7.98。NbSPT3预测分子质量为40.75 kDa,理论等电点pI 4.67。通过对三个NbSeptin的氨基酸序列进一步分析发现其均存在Septin蛋白家族保守的GTP结合结构域。多重序列比对发现3个NbSeptin的氨基酸序列差异较大,说明NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3可能发挥着不一样的功能。进化分析结果显示,多种微孢子虫中都存在NbSeptin的同源基因,表明在微孢子虫中Septin蛋白的分布较为保守,且3个septin的同源基因分别聚为一枝,说明Septin在不同的微孢子虫中可能发挥着相似的作用。同时NbSPT1与S.cerevisiae CDC11、SHS1、SPR28、CDC12和SPR3聚为一枝,NbSPT2与S.cerevisiae CDC3聚为一枝,NbSPT3与S.cerevisiae CDC10聚为一枝,说明NbSeptin的功能可能与其对应的酿酒酵母Septin的功能具有相似性。为了了解家蚕微粒子虫增殖过程中NbSeptins的转录特征,以感染家蚕微粒子虫1~4 d的Sf9细胞为材料,通过RT-qPCR进行检测,结果显示三个NbSeptin在家蚕微粒子虫感染细胞的1~4d均能检测到转录,且均在第二天高量转录,推测NbSeptins可能在家蚕微粒子虫裂殖增殖期发挥重要作用。2.NbSeptins的抗体制备及亚细胞定位分析基于家蚕微粒子虫NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3的基因序列设计特异引物,采用PCR扩增的方法克隆三个基因并构建pColdI-NbSPT1、pET30-NbSPT2和pColdI-NbSPT3表达载体,转化到E.coli Rosseta表达菌,经0.2 mM IPTG诱导剂在16℃和180 rpm条件下诱导获得NbSeptins的重组蛋白。目的蛋白经亲和层析纯化后免疫小鼠和兔子,制备了多克隆抗体。免疫印迹分析显示在家蚕微粒子虫成熟孢子和感染家蚕微粒子虫的Sf9细胞的总蛋白中,anti-NbSPT1、anti-NbSPT2和anti-NbSPT3分别能够检测到35 kDa、37 kDa和40 kDa左右的蛋白条带,大小与预测的分子量一致。建立家蚕微粒子虫感染的昆虫细胞模型,采用间接免疫荧光技术(IFA)对NbSeptins在感染家蚕微粒子虫的Sf9细胞中的定位进行分析显示,NbSeptins主要定位于裂殖体膜,且NbSPT1与NbSPT3、NbSPT2与NbSPT3在裂殖体膜上存在共定位,而NbSPT2与NbSPT3在部分家蚕微粒子虫的一对耦核之间存在线状共定位,表明NbSeptins在家蚕微粒子虫裂殖增殖期发挥功能,且NbSPT2和NbSPT3可能跟家蚕微粒子虫细胞核的分裂有关。3.家蚕微粒子虫NbSeptins的互作分析鉴于NbSeptins在裂殖体膜上具有共定位特征,且Septins蛋白常以聚合体形式行使功能,本部分采用酵母双杂交和免疫共沉淀技术分析NbSeptins的相互作用关系。构建酵母双杂交载体pGBKT7-NbSPT1、pGBKT7-NbSPT2、pGADT7-NbSPT1和pGADT7-NbSPT3载体转入酵母细胞并进行细胞融合以检测NbSeptins之间的相互作用,结果显示融合后的Y187[pGADT7-NbSPT1]/AH109[pGBKT7-NbSPT2]、Y187[pGADT7-NbSPT3]/AH109[pGBKT7-NbSPT1]和Y187[pGADT7-NbSPT3]/AH109[pGBKT7-NbSPT2]能够激活下游报告基因的表达,证明NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3之间存在相互作用。利用免疫共沉淀技术,分别提取感染家蚕微粒子虫的Sf9细胞总蛋白和成熟家蚕微粒子虫蛋白,以NbSPT2和NbSPT3为诱饵蛋白沉淀互作蛋白,采用免疫印迹分析NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3的互作关系。结果表明NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3之间存在相互作用,说明NbSeptins之间是可以通过形成异源聚合物在家蚕微粒子虫中发挥功能。