论文部分内容阅读
目的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的非造血干细胞,它的多向分化潜能,造血支持功能,低免疫源性,免疫调节功能及再生功能,使其成为一种具有临床应用前景的祖/干细胞来源。近年来,间充质干细胞的免疫抑制功能备受关注。国内外众多研究表明,成人骨髓间充质干细胞、脂肪源性间充质干细胞和脐带间充质干细胞等不同组织来源的MSCs都具有免疫抑制功能,在体外可抑制B细胞和T细胞增殖和分化,抑制DC细胞成熟,抑制NK细胞活性等；在体内,MSCs对GVHD和自身免疫性疾病都具有显著的治疗作用。作为胎儿组织来源的MSCs,胎肝间充质干细胞(fetal liver derived mesenchymal stem cells, FL-MSCs)及胎儿骨髓间充质干细胞(fetal bone marrow derived mesenchymal stem cells, FBM-MSCs)伴随胎儿发育期间骨髓造血微环境的逐步形成。FL-MSCs及FBM-MSCs在自我更新、多向分化潜能和高度增殖等干细胞基本生物学特征方面,与成人骨髓间充质干细胞类似。但是,目前关于这两种细胞免疫学特性的研究鲜见报道。对这两种细胞免疫学特性的研究,可能有助于我们更深入的了解FL-MSCs及FBM-MSCs在胎儿造血微环境及造血发育调节等重要生理功能中的作用。早期研究表明造血细胞的增殖和分化受骨髓微环境的调控,而骨髓微环境是一个三维立体的培养空间,基质细胞是其中的重要组成部分,基质细胞通过分泌细胞因子、细胞外基质以及细胞与细胞之间的直接接触来调节造血干细胞的增殖与分化,维持造血干细胞的干性。然而大多数关于基质细胞调控造血细胞生长及自我更新能力的研究都是利用平面培养系统进行的,而且大部分的结果显示培养四至八周后,造血细胞即会开始减少。这种造血支持缺陷是否能够在三维培养体系中得到改善还缺乏进一步研究,因此,我们建立了三维立体的培养系统,研究脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)在三维立体条件下的生物学特性变化,以便以后更好地研究三维立体条件下的造血扩增及分化。方法1.间充质干细胞的培养和鉴定：原代培养人FBM-MSCs和FL-MSCs;通过形态学观察,流式细胞术检测表面分子的表达,Alizarin Red S、Von Kossa及Oil RedO染色和LPL、OPN相关基因的表达检测多向分化潜能。2. FBM-MSCs及FL-MSCs的生长特性：通过连续传代观察两种细胞的生长速度；观察连续传代后细胞形态变化,流式细胞术检测连续传代后细胞表面分子的表达。3. FBM-MSCs及FL-MSCs对PBMC增殖的影响：分离外周血单个核细胞(PBMC);利用MSC/PBMC体外共培养体系,CFSE法检测PBMC的增殖,ELISA法及RT-PCR检测炎性细胞因子的蛋白分泌水平及mRNA表达水平;利用RT-PCR检测该体系中FBM-MSCs及FL-MSCs共培养前后,多种免疫抑制性细胞因子分泌水平的变化。4.细胞-细胞接触在免疫抑制中的作用：Transwell实验检测细胞-细胞接触的作用；RT-PCR检测共培养体系中FBM-MSCs及FL-MSCs共培养前后粘附分子ICAM1, ICAM3和VCAM1的表达。5. UC-MSCs的三维培养：从脐带中分离出MSC,分别在二维及三维条件下培养；通过流式细胞技术检测MSC表面抗原的表达水平；通过成血管试验比较了两种细胞的成血管能力；并通过RT-PCR检测两种培养条件下造血相关细胞因子的基因表达情况。结果1.成功地分离出了FBM-MSCs及FL-MSCs;我们所培养的胎儿骨髓和胎肝MSC均可旺盛增殖,呈现典型的成纤维样梭行细胞形态,高表达CD29、CD44、CD49e、 CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞的表面标记CD34、CD45,内皮细胞的表面标记CD31及GVHD相关的CD80、CD86、CD106、HLA-DR。此外两种MSC低表达CD146、HLA-ABC;在诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,并表达其特异性标志。2. FL-MSCs生长速度较FBM-MSCs快；连续传代以后两种细胞仍保持间充质干细胞的一些基本生物学特性。3. FBM-MSCs及FL-MSCs对PBMC的增殖和炎性因子IFN-γ和TNF-α分泌具有明显的抑制作用；共培养后,FBM-MSCs及FL-MSCs表达IDO、TSG-6和TGF-β的水平明显提升。4.细胞-细胞接触在两种细胞的免疫抑制中发挥重要作用；共培养后,FBM-MSCs及FL-MSCs表达ICAM1的水平明显提升。5.从脐带中成功地分离出了MSC；在三维培养条件下其内皮细胞、内皮祖细胞和间充质原始干细胞的表面标记CD31、CD133和CD271等阳性细胞百分比显著增加,体外成血管能力增强；骨架蛋白β-Actin基因在三维培养条件下表达上调,G-CSF、LIF、SCF、IL-lα、IL-1β、IL-3、IL-7和IL-11等与造血调控有关的细胞因子基因表达也有不同程度的增高,其中LIF、IL-3和IL-7升高尤为明显；免疫调控相关的细胞因子IL-10的表达也增高；SDF-1和IL-6的表达虽有轻微的降低,但无显著性差异。结论1.胎儿骨髓和胎肝均可获得MSC,符合国际细胞治疗协会对MSC的定义；FBM-MSCs的成骨成脂分化能力高于FL-MSCs,但是增殖能力低于FL-MSCs;多次传代后仍保持间充质干细胞的一些基本生物学特性。2. FBM-MSCs及FL-MSCs具有较低的免疫原性；FBM-MSCs及FL-MSCs在体外对PBMC具有显著的免疫抑制作用；其分泌的抑制性细胞因子IDO、TSG-6和TGF-β及细胞-细胞接触可能在其介导的免疫抑制中具有重要作用。3.三维培养条件下UC-MSCs的CD31、CD133和CD271表达上调,体外成血管能力增强,并且多个造血相关因子的基因表达水平上调。