研究背景:骨性关节炎（osteoarthritis,OA）是全世界中老年人群最常见的骨关节疾病,是引起膝关节疼痛和致残的主要原因,但是目前还没有预防或治愈膝骨性关节炎的治疗方法。由于间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有免疫调节和分化的潜能,越来越多的研究将其应用于缺损组织的再生,脂肪干细胞（Adipose tissue-derived stem cells,ADSCs）是MSCs的类型之一,与其他组织的MSCs具有相似的表面标志物和分化潜能,但相比其他组织来源的MSCs,ADSCs具有量大、易获取的优势,其已经被成功应用于治疗OA动物模型。外泌体是由细胞分泌的一种囊泡,其内部含有蛋白质、DNA、RNA和脂质等具有生物活性的物质,能够通过旁分泌、邻分泌和内吞三种方式被受体细胞吸收,并影响受体细胞的生物过程,研究发现MSCs来源的外泌体在损伤的软骨中具有修复作用。Wnt信号通路在维持关节的完整性上非常重要,β-catenin水平的过度和不足会分别通过增强病理性成熟和凋亡破坏关节软骨细胞的平衡,在OA软骨组织中存在β-catenin水平的上调。自噬是进化保守的过程,细胞内部的维护有赖于持续自噬的作用,研究表明OA中自噬具有保护软骨的作用,并且在其他疾病和细胞的研究中发现Wnt/β-catenin信号通路可以负向调控自噬反应。目前对于ADSCs来源外泌体治疗OA的疗效及相关机制研究尚有限,ADSCs来源外泌体是否会调节软骨细胞中β-catenin及自噬,从而影响软骨细胞的性能尚未见研究。因此,本研究将从以下三个方面进行研究:（1）抽脂术及直接切取脂肪组织中获取的ADSCs其细胞性能是否有差异;（2）动物体内观察ADSCs及ADSCs来源外泌体对OA模型大鼠滑膜及软骨组织的治疗效果及它们之间的比较;（3）ADSCs来源外泌体对OA患者来源滑膜成纤维细胞和软骨细胞的作用以及对软骨细胞中β-catenin和自噬的影响。第一部分脂肪干细胞及其外泌体的提取及鉴定目的:从抽脂术及髋关节置换术中获取的脂肪组织中提取ADSCs,并且从ADSCs培养基中提取外泌体,对ADSCs的表型、分化能力及外泌体形态、标志蛋白的表达进行鉴定。方法:采用胰酶与胶原酶联合消化的方式从抽脂术及髋关节置换术获得的脂肪组织中提取ADSCs,采用流式细胞术分析细胞的表面标志。将ADSCs向成骨、成脂、成软骨诱导,以茜素红、油红O及阿利新蓝染色鉴定成骨、成脂、成软骨潜能,荧光定量PCR检测诱导后OCN、PPARγ、COL2A1 mRNA的表达,采用CCK8检测ADSCs的增殖能力,比较两种来源ADSCs三系分化及增殖能力的差异。通过超速离心法获取ADSCs来源的外泌体,采用透射电镜及Western blot鉴定外泌体。结果:从抽脂术来源和髋关节置换术来源脂肪组织中获取的细胞为形态一致的成纤维样细胞,表面标志物均为CD31、CD34、CD45阴性表达,而CD73、CD90、CD105阳性表达,符合ADSCs表面标志物的表达,抽脂术来源和髋关节置换术来源的ADSCs具有相似的增殖能力和三系分化潜能;从两种来源ADSCs培养基中通过超速离心法能够获取直径在50nm～100nm之间的外泌体,特异性标记蛋白CD9和CD63阳性。结论:抽脂术和髋关节置换切取脂肪组织获取的ADSCs表面标志物、三系分化潜能及增殖能力相似,均能通过超速离心法从培养基中获取外泌体。第二部分ADSCs及其来源外泌体对OA模型大鼠的治疗效果的研究目的:观察ADSCs及其来源外泌体对OA模型大鼠行为学、滑膜组织及软骨组织的影响。方法:应用Hulth法制备OA大鼠模型,选取24只OA造模4周后的SD大鼠按随机数字表法分为3组,每组各8只。A组为对照组,采用60μL生理盐水关节腔注射;B组为ADSCs组,将1×10⁶个ADSCs以60μL生理盐水重悬后注射至OA大鼠膝关节;C组为外泌体组,采用ADSCs来源外泌体(10¹¹颗粒/m L)关节腔注射治疗。所有大鼠均每周接受2次注射,共干预8周。观察大鼠干预后行为学指标、滑膜及关节面病理切片以及相关基因、蛋白的表达情况。结果:所有大鼠在治疗期间均未出现并发症。在造模成功后采用ADSCs、ADSCs来源外泌体治疗8周,结果显示B组和C组大鼠疼痛刺激反应、步态、活动度和肿胀均比A组症状轻,差异具有统计学意义（P<0.05）;而B组和C组之间比较无明显差异（P>0.05）。滑膜HE染色显示A组滑膜组织中存在大量淋巴细胞的浸润,滑膜细胞增生,复层化。而B组和C组滑膜组织中滑膜细胞及间质淋巴细胞减少,炎症反应减弱,滑膜细胞状态趋于正常。番红O-固绿染色显示A组软骨结构紊乱,软骨细胞固缩,番红O-固绿染色减弱,潮线破坏;而B组和C组软骨结构相对完整,软骨细胞正常,番红O-固绿染色颜色深,潮线相对完整。A组改良Mankin’s评分平均为8.6分,B组和C组分别为3.4分和3.6分,A组明显高于B组和C组,差异具有统计学意义（P<0.05）,而B组和C组之间比较无明显差异（P>0.05）,表明A组软骨破坏要比B组、C组严重。A组滑膜组织中TNF-α基因及蛋白的表达要明显高于B组、C组,IL-10基因及蛋白的表达低于B组、C组;软骨组织基因及蛋白检测显示B组、C组II型胶原基因和蛋白表达高于A组。结论:ADSCs来源外泌体治疗OA模型大鼠的疗效与ADSCs相似,均能减轻滑膜组织的炎症反应,并且对软骨组织具有修复作用。第三部分ADSCs来源外泌体对OA患者滑膜成纤维细胞及软骨细胞的作用及相关机制的研究目的:探索ADSCs来源外泌体对OA患者来源滑膜成纤维细胞炎症因子分泌及软骨细胞的抗凋亡及迁移的影响。方法:分离获取OA患者来源的滑膜成纤维细胞及软骨细胞,将ADSCs来源外泌体干预活化状态下滑膜成纤维细胞,观察干预后炎症因子的表达情况;将ADSCs来源外泌体与H₂O₂干预的软骨细胞进行共培养,观察其对软骨细胞凋亡的影响;软骨细胞接受滑膜成纤维细胞条件培养基及ADSCs来源外泌体干预,观察迁移能力的变化,检测β-catenin及自噬指标的改变。结果:ADSCs来源的外泌体与OA患者来源的活化状态下成纤维滑膜细胞共培养,结果显示活化状态下成纤维滑膜细胞在外泌体治疗后能显著减少IL6、TNF?α和NF?κB的炎症生物指标的水平,同时增加抗炎指标IL-10的水平。在观察到ADSCs来源外泌体能够减轻活化状态下滑膜成纤维细胞的炎症后,本研究继续研究了ADSCs来源外泌体对关节软骨细胞氧化应激情况下凋亡的影响。本研究将关节软骨细胞培养后以H₂O₂干预,用来模拟关节滑膜中M1巨噬细胞诱导的氧化应激反应,在H₂O₂干预后会明显增加软骨细胞的凋亡;在加入ADSCs来源外泌体干预后,结果显示随着外泌体浓度的增加,软骨细胞凋亡数量明显减少。根据ADSCs来源外泌体对软骨细胞凋亡实验结果,10×10¹⁰ particles/m L外泌体浓度对软骨细胞干预最为明显,后续实验我们均采用该浓度进行。为了观察活化状态下滑膜成纤维细胞条件培养基对软骨细胞迁移的影响及ADSCs来源外泌体的干预作用,我们分为对照组、条件培养基组和外泌体+条件培养基组。本研究显示软骨细胞在条件培养基培养下MAPLC3B mRNA表达降低,而CTNNB1、P62 mRNA表达升高,蛋白检测显示LC3II/I比例降低,β-catenin、P62蛋白表达升高;在外泌体干预后MAPLC3B mRNA表达升高,而CTNNB1、P62 mRNA表达降低;对相应蛋白检测显示LC3II/I比例升高,β-catenin、P62蛋白表达降低。既往研究显示β-catenin可以调控自噬的降解,本研究中结果显示外泌体增加自噬的同时降低了β-catenin的表达,这提示外泌体可能通过减少β-catenin,增加细胞内的自噬反应,从而促进了软骨的迁移。为了证实自噬对软骨细胞迁移的影响,我们采用自噬抑制小分子药物3-MA（20μM）干预,结果显示3-MA干预后软骨细胞迁移能力明显降低,基因检测显示3-MA干预后P62 mRNA升高,MAP1LC3B mRNA表达下降,β-catenin mRNA的表达与外泌体干预比较无明显差异,而相比对照组比较降低,蛋白检测也显示LC3II/I比例降低,P62蛋白表达升高,而β-catenin无明显改变。结论:ADSCs来源外泌体能够减少活化状态下滑膜成纤维细胞促炎因子的释放,增加抗炎因子的表达,减少氧化应激状态下软骨细胞的凋亡,同时它通过调节β-catenin/自噬通路,增加软骨细胞的自噬,促进其迁移能力的提高,从而起软骨修复的作用。