耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是一种能在极端环境胁迫下生存的细菌,由于具备极强的抗辐射能力,现已作为研究DNA损伤和修复机制的模式生物。耐辐射奇球菌的DNA损伤响应开关蛋白Ppr I调控着众多基因表达,在DNA损伤修复过程中起决定性作用。蛋白质翻译后修饰是近年来比较热门的一块研究领域,其中的磷酸化修饰广泛存在于真核生物和原核生物中,参与生命体内多种生理活动,在蛋白功能行使中具有重要地位。本研究以探索Ppr I的磷酸化位点功能为目的,通过生物信息学检索、质谱检测、分子生物学与生物化学的实验方法,分析了Ppr I磷酸化位点的功能与作用机制,获得的主要实验结果如下:(1)生物信息学方法预测到Ppr I蛋白翻译后修饰中存在磷酸化修饰、乙酰化修饰和类泛素化修饰。预测分析Ppr I蛋白存在较多的磷酸化修饰位点,尤其在C末端可能存在与蛋白结合信号分子相关的多个磷酸化修饰位点。(2)在ppr I基因补偿质粒上添加特异性的18×His标签,通过在辐照前后的菌体内富集Ppr I蛋白并经质谱检测,得到12个可靠性较强的磷酸化修饰位点,分属于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸三种类型,位点分布于Ppr I蛋白三个不同的结构域上。(3)构建了质谱筛选出的12个Ppr I磷酸化修饰位点突变的重组菌株,每个位点均突变成“模拟持续去磷酸化的突变成丙氨酸(A)”和“模拟持续磷酸化的突变成天冬氨酸(D)”两种类型。对突变菌株进行体内功能分析,在γ辐照和UV辐照处理后,YR2-T150D、YR2-Y208A、YR2-Y208D、YR2-S302D和YR2-T176A这5个点突变株的生存率相对于对照明显下降,说明磷酸化位点突变后对菌株的抗性影响更大。点突变菌株体内辐照前后Ddr O表达水平检测结果表明,YR2-T150D、YR2-Y208D和YR2-S302D菌株体内的Ddr O表达水平基本未变,YR2-T176A菌株的Ddr O表达量有所下降,说明这些点突变破坏了Ppr I的功能行使,与表型抗性试验结果相一致。(4)构建了T150A/D、T176A/D、Y208A/D和S302A/D等Ppr I磷酸化修饰位点突变的表达菌株,优化了蛋白诱导表达条件,并在体外纯化了8个点突变和野生型Ppr I蛋白。分析Ppr I磷酸化修饰位点突变蛋白酶切Ddr O的实验结果表明,Y208A和T176A点突蛋白的酶活下降明显;而其他6个点突蛋白的酶活几乎不受影响。同时构建了p ET28sf-RNAP(RNA polymaraseβ)表达菌株,着手研究磷酸化点突变对其Ddr O与RNAP蛋白互作的影响。本论文研究发现了耐辐射奇球菌中Ppr I蛋白的重要磷酸化修饰位点,综合分析表明Ppr I的磷酸化修饰影响其功能发挥,对耐辐射奇球菌的超强抗性具有重要作用。特别是T150、T176、Y208和S302这4个氨基酸位点,突变成丙氨酸(A)或天冬氨酸(D)后显著影响菌株抗性和蛋白酶体外活性,说明其影响了Ppr I蛋白介导的修复调控途径。