棉子糖家族寡糖提高番茄低温抗性的作用研究

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番茄(Solanum Lycopersicum L.)属喜温果菜类蔬菜,在1333℃可正常生长,低温逆境会降低番茄果实的产量与品质。已有研究表明,棉子糖寡糖在植物抗低温逆境胁迫中具有重要作用,沙冬青(A.nanus)棉子糖寡糖代谢的关键酶-肌醇半乳糖苷酶(AnGolSs)超表达番茄植株抗寒性显著提高。本试验分析了番茄肌醇半乳糖苷合成酶(SlGolSs)在低温逆境下的表达水平,并通过外源施用棉子糖寡糖代谢相关物质研究了SlGolSs及其他棉子糖代谢关键酶表达的影响,明确棉子糖家族寡糖对番茄低温抗性的提升作用;在大肠杆菌中进行SlGolSs蛋白原核表达,分析肌醇半乳糖苷合成酶在低温胁迫下的作用;最终将筛选确定的SlGolSs在番茄中过表达,以期提高番茄的低温抗性。论文主要结论如下:(1)利用qRT-PCR分析了低温处理后番茄根、茎、叶SlGolS1,2,3,4基因表达水平,低温处理下SlGolS2,4在番茄根、茎、叶中高效表达,且随处理时间逐渐升高。说明SlGolS2,4与番茄植株低温响应密切相关。(2)外源喷施棉子糖、蔗糖、肌醇、肌醇半乳糖苷(Gol)、亚胺糖1-脱氧半乳糖野生霉素(DGJ,α半乳糖水解抑制剂)、Gol+DGJ,测定各处理MDA、CAT、GSH、POD、SOD、H2O2、相对电导率,并用qRT-PCR分析低温胁迫下番茄SlGolS等基因表达量变化,结果表明:外施Gol、DGJ和DGJ+Gol对番茄低温胁迫下抗逆性的提升在生理水平上显著高于外施肌醇、蔗糖和棉子糖;Sl-GolS2,4、Sl-RS1,2,3、SlStas、Slα-ga1、Slα-ga2、Slα-ga3在低温胁迫下都会上调表达,但Sl-GolS2,4在表达量数量级上远高于其他基因,说明这些基因都受低温胁迫的调控,Sl-GolS2,4在低温响应中起主要作用,通过高效表达的方式调节Gol含量抵抗低温胁迫,而外施Gol也会起到相同效果。(3)为了验证SlGolS2,4基因的抗冷功能,将重组质粒转入BL21大肠杆菌感受态细胞中,加入IPTG诱导SlGolS2,4蛋白在大肠杆菌内表达,-20℃处理6h后,pet32a-SlGolS2,4的菌落数量明显多于pet32a-SlGolS1,3和pet32a空载对照,这说明SlGolS2,4蛋白的表达能够增强大肠杆菌的低温抗性,提高菌落存活率。(4)构建SlGolS2,4转基因重组质粒并通过农杆菌转化法,经过一系列的转化、培养和最终的筛选鉴定,获得了转SlGolS2,4超表达番茄植株;利用PCR扩增鉴定阳性转基因番茄幼苗,最终获得17株转SlGolS2超表达番茄T0代植株以及10株转SlGolS4超表达番茄T0代植株。
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