研究背景神经病理性疼痛（Neuropathic Pain,NP）是一种影响躯体感觉神经系统的损伤或疾病引起的疼痛。NP困扰着世界多达10%的人口,其中半数以上的患者情况较严重,是当前最大的全球性公共卫生问题之一。目前临床常用的药物治疗方案普遍效果不理想,只有约40-60%的病人症状得到部分缓解。脊髓电刺激（Spinal Cord Stimulation,SCS）是一种重要的NP替代性治疗手段,特别是当其他治疗无效或产生严重药物相关副作用时。在过去的几十年间,SCS技术不断发展,通过众多新颖的设备和刺激方式取得了良好的临床效果,但其治疗NP的内在机制尚不明确,关于其机制的研究也似乎一直在黑暗中摸索。由于动物实验与实际临床使用电极设计差异、刺激模式的不同、刺激强度的选择标准不一等原因,使得动物实验很难完全模拟临床应用实际情况。更贴近临床实际应用的动物模型,将会更有利于动物实验为临床运用的机制研究和临床使用提供支持。因此,本研究拟采用美敦力公司定制四级电极,通过基因工具鼠,运用动物行为学、免疫组织化学、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Polymerase Chain Reaction,Real-time PCR）和免疫印迹Western Blot分析和电生理等方法,研究啮齿动物的神经病理性疼痛模型中脊髓神经元CB1受体及小胶质细胞在SCS疼痛抑制中的作用。研究方法与结果第一部分:SCS镇痛的动物模型建立及行为学效果评价方法:采用雄性SD大鼠,建立坐骨神经慢性压迫性损伤（Chronic Sciatic Nerve Constriction Injury,CCI）神经病理性疼痛动物模型,CCI手术前一天测机械缩爪阈值（Paw Withdrawal Threshold,PWT）基础值,术后7天行电极植入手术。CCI术后第15天,大鼠接受30分钟的持续SCS或Sham SCS刺激。于刺激前,刺激中30分钟,刺激停止后30分钟和60分钟分别检测PWT。CCI术后第16天,大鼠接受3小时的持续SCS或Sham SCS刺激。于刺激前,刺激中30、60、120、180分钟,刺激停止后30分钟和60分钟分别检测PWT。于CCI术后第18天至第20天连续3天接受SCS或Sham SCS。每天上午于刺激前,刺激中30、60、120、180分钟分别检测PWT。另一组SD大鼠建立CCI模型,CCI术后7天植入电极,第15-17天行条件性位置偏爱实验（Conditioned Place Preference,CPP）适应训练,18天测定CPP前测,19-21天行CPP训练,22天测试CPP后测。结果:从CCI术后第3天开始,CCI组大鼠手术侧PWT值显著下降,到术后第7天呈持续下降趋势。30分钟及3小时连续SCS过程中,PWT显著升高,且在60分钟到120分钟之间达到峰值,SCS刺激停止后30分钟和60分钟,CCI+SCS组与CCI+Sham SCS组PWT无显著差异。3天连续SCS第一天,刺激过程中第30分钟、60分钟和第120分钟,CCI+SCS组PWT值显著升高,第180分钟PWT下降;SCS第二天和第三天,刺激过程中第30、60、120和180分钟,CCI+SCS组PWT值显著升高。对比CCI+SCS组3天同一SCS刺激时间点PWT值差异无统计学意义。将CCI+SCS组每天SCS刺激期间的PWT取平均值,第二天SCS平均PWT高于第一天,第三天平均PWT则与第一天和第二天差异无统计学意义。CPP实验中,大鼠在SCS实验箱停留时间,后测（Post）与前测（Pre）差异无统计学意义;大鼠在Sham SCS实验箱停留时间,后测（Post）与前测（Pre）差异亦无统计学意义。CPP得分（后侧值减去前测值）,SCS组与sham组差异无统计学意义。第二部分:小胶质细胞参与SCS镇痛的潜在机制方法:第一部分实验动物取材并分别通过免疫荧光反应、Real-time PCR和WesternBlot检测CCI及SCS后脊髓星形胶质细胞特异性标记物（GFAP）和小胶质细胞特异性标记物（OX-42）蛋白质及m RNA表达变化。通过Real-time PCR检测CCI及SCS后大鼠脊髓小胶质细胞M1型活化标记物（i NOS,CD16,CD32）、M2型活化标记物（CCI,CD163,TGF-β）,以及促炎细胞因子（IL-1β,TNF-α）和抗炎细胞因子（IL-4,IL10）m RNA表达水平变化。通过Western Blot检测SCS所致CCI大鼠脊髓小胶质细胞活化标记物（i NOS,Arg1）和细胞因子（TNF-α,IL-10）以及脊髓伤害感受性分子（p-ERK1/2,c-Fos,BDNF,PKC-γ,p-NR1,p-Glu R1ser831）的蛋白质表达水平变化。随后检测鞘内注射不同剂量小胶质细胞抑制剂米诺环素对CCI大鼠PWT的影响,并通过低剂量米诺环素鞘内注射预处理联合SCS观察其镇痛效果。结果:免疫荧光结果显示,CCI大鼠脊髓损伤侧背角GFAP和OX-42表达均明显增强,SCS对CCI大鼠脊髓损伤侧和对侧背角OX-42的表达均有明显增强作用,而对双侧脊髓背角GFAP的表达则无明显影响;Real-time PCR和Western Blot结果与此一致。Real-time PCR结果显示,CCI大鼠CD16和CD32（M1型特异性分子标记物）的m RNA水平显著高于Na（?）ve大鼠;SCS显著增加CCI大鼠CD16和i NOS的m RNA水平。CCI大鼠和Na（?）ve大鼠促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的m RNA水平相似,但在SCS后IL-1βm RNA水平显著升高。CCI和SCS对M2型特异性分子标记物Arg1,CD163和TGF-β的m RNA水平无影响。CCI大鼠的抗炎细胞因子IL-4和IL-10的m RNA水平显著低于Na（?）ve大鼠,SCS对其无影响。脊髓背角组织的Western Blot分析表明,SCS大鼠脊髓背角损伤侧的i NOS表达上调,但TNF-α,Arg1和IL-10的表达无变化。Western Blot结果还显示,Sham SCS的CCI大鼠的损伤侧脊髓中的p-ERK1/2水平显著高于Naive大鼠;但两组之间的c-Fos,BDNF,PKC-γ,p-NR1和p-Glu R1ser831蛋白质水平没有显著差异。与Sham SCS相比,SCS显著降低CCI大鼠的BDNF水平。鞘内注射小胶质细胞抑制剂米诺环素,可剂量依赖性地减轻CCI大鼠同侧后爪的机械性超敏反应;鞘内注射低剂量米诺环素预处理可延长SCS的镇痛作用。第三部分:CB1受体在SCS镇痛中的作用方法:分别采用v Glut2-Cre:Rosa 26-Td Tomat和GAD1-GFP基因工具小鼠制作组织切片,并通过免疫荧光染色检测CB1受体分别在谷氨酸能兴奋性神经元和γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid,GABA）能神经元中的表达情况。以上小鼠制作脊神经结扎（Spinal Nerve Ligation,SNL）神经病理性疼痛模型,于术后第7天通过脊髓切片的全细胞膜片钳检测与临床SCS参数（50Hz,0.2ms,10μA）相似的Aβ纤维电刺激（electrical stimulation of Ab-fibers,Aβ-ES）对胶状质（Substantia Gelatinosa,SG）谷氨酸能兴奋性和GABA能抑制性中间神经元中C纤维输入所致诱发兴奋性突触后电流（Evoked Excitatory Postsynaptic Currents,e EPSCs）的影响。随后给予CB1受体拮抗剂AM251预处理（2μM,5min）,记录Aβ-ES所致e EPSCs的变化。最后通过大鼠SNL动物模型,分别观察AM251（50μg）、CB2受体拮抗剂AM630（100μg）和大麻素吸收阻断剂LY2183240（50μg）预处理后,SCS（50 Hz,80%Mo T,0.2ms,60分钟）对SNL大鼠行为学的影响。结果:免疫荧光结果显示v Glut2-Td+的SG神经元中,有52.3%对CB1受体免疫反应呈阳性;Aβ-ES诱导SNL小鼠脊髓切片v Glut2-Td+神经元中C纤维输入所致反应性e EPSCs长时间抑制,AM251预处理阻断了Aβ-ES对C-e EPSC的抑制作用,且在给药后5分钟即可使C-e EPSC稳定。71.4%的SG GAD1-GFP+神经元表达CB1受体;Aβ-ES后GAD1-GFP+神经元的C-e EPSC振幅逐渐降低,AM251预处理可部分降低Aβ-ES的抑制作用。动物行为学数据显示,鞘内注射AM251减弱了SCS诱导的PWT升高,AM630对SCS诱导的PWT升高无明显影响,而LY2183240增强了SCS诱导的PWT升高;AM251与LY2183240联合预处理时,AM251阻断了LY2183240对SCS镇痛的增强作用。结论1.SCS刺激过程中可产生持续镇痛效果,但刺激停止后镇痛作用消失;CPP实验结果显示,大鼠对SCS治疗未形成依赖。2.SCS增加了脊髓M1样小胶质细胞的激活,以致降低了其自身的镇痛效果,小胶质细胞抑制剂预处理可延长SCS的镇痛作用。3.CB1受体在SCS诱导的疼痛抑制中发挥重要作用。CB1受体拮抗剂可减弱SCS镇痛效果,内源性大麻素降解抑制剂可增强SCS的疗效。CB1受体可为提高SCS镇痛效果提供新的作用靶点。