【摘 要】
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背景和目的众多研究报道,N-Myc下游调控基因1（NDRG1）在不同肿瘤类型,如结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）,前列腺癌,胰腺癌中起到抑制肿瘤侵袭和转移的作用。我们在前期的研究中发现,下调NDRG1表达能明显促进CRC细胞发生上皮-间充质转换（EMT）,从而增加肿瘤细胞的迁移侵袭能力。众多研究表明,发生EMT的肿瘤细胞可能会表现出不同程度的干细胞样特征。然而NDRG1是否能
【基金项目】
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国家科技攻关计划（2012AA021103）； 上海市科委基础研究领域项目（13JC1404100）； 国家自然科学基金（81201625,81402423）；
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背景和目的众多研究报道,N-Myc下游调控基因1（NDRG1）在不同肿瘤类型,如结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）,前列腺癌,胰腺癌中起到抑制肿瘤侵袭和转移的作用。我们在前期的研究中发现,下调NDRG1表达能明显促进CRC细胞发生上皮-间充质转换（EMT）,从而增加肿瘤细胞的迁移侵袭能力。众多研究表明,发生EMT的肿瘤细胞可能会表现出不同程度的干细胞样特征。然而NDRG1是否能抑制CRC细胞的干性尚未见文献明确报道。因此,本研究以该问题为出发点,探讨NDRG1对CRC干性的影响,并探讨其可能的发生机制。研究方法:1.利用以往成功构建并筛选的稳定过表达NDRG1基因及稳定沉默NDRG1基因的CRC细胞株HCT116和HT29为细胞模型。运用上述细胞克隆,我们首先在体外实验中（in vitro）探究了NDRG1过表达及基因沉默对CRC细胞体外一系列“干细胞样”表型的影响,包括一代、二代无血清成球能力、侵袭转移能力、克隆形成能力和化疗耐药性等。将HT29细胞进行梯度稀释后,种植于裸鼠体内（in vivo）,观察不同NDRG1表达的HT29细胞在体内致瘤性的差别。2.体外用流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测NDRG1过表达或沉默对CRC细胞表面干性分子CD44、CD133表达的影响;用逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription PCR,RT-PCR）检测不同NDRG1表达对细胞内其它干性转录分子（如OCT4,NANOG,SOX2,ALDH1）m RNA转录的影响。3.免疫荧光技术（Immunofluorescence,IF）观察NDRG1表达对β-catenin在细胞中定位的影响;抽提不同细胞组分蛋白（全蛋白、核蛋白、膜蛋白）,Western Blot检测NDRG1对不同细胞组分中β-catenin表达的影响,并检测β-catenin下游蛋白c-myc和cyclin D1的表达水平;TOP/FOP Flash assay技术检测β-catenin转录活性变化,用以反映NDRG1对Wnt信号通路活性的影响。4.为研究NDRG1是否通过β-catenin抑制CRC细胞的干性,我们在NDRG1稳定下调的细胞（sh NDRG1）和对照细胞（sh Con）中干扰下调β-catenin,并在体外实验中观察下调β-catenin表达后能否逆转NDRG1低表达造成的干性增强的表型。5.研究NDRG1在临床CRC组织和相应正常组织间的表达的差异;分析NDRG1表达与CRC临床病理资料指标的关系;在组织水平研究NDRG1、β-catenin和干性分子CD44是否具有共同定位表达关系,分析其表达的相关性。研究结果:1.在NDRG1过表达的CRC细胞HCT116和HT29中,上述干细胞样表型（无血清成球能力;转移侵袭能力;克隆形成能力;化疗抗性）均受到不同程度的抑制,而在稳定下调NDRG1的细胞中,这些干性特征获得明显增强。NDRG1过表达明显抑制HT29细胞在裸鼠体内的有限稀释致瘤能力,表现为瘤体出现晚、出现比率低;瘤体生长慢、重量轻。2.NDRG1显著下调CRC干性标志物CD44的表达,下调NDRG1明显增强CD44分子在膜上的表达,而NDRG1对干性分子CD133的表达无明显影响。NDRG1过表达抑制OCT4和NANOG的转录,而下调NDRG1却显著增强SOX2的转录,NDRG1表达变化对ALDH1的转录无明显影响。3.NDRG1过表达能明显促进β-catenin在细胞膜上的分布并抑制其细胞核转位,进而抑制其转录活性及下游靶蛋白c-myc和cyclin D1的表达,而下调NDRG1却表现出相反的特点。4.在下调NDRG1的细胞（sh NDRG1）及对照细胞（sh Con）中同时干扰下调β-catenin（shβ-catenin）的表达后,β-catenin转录活性明显降低而且靶蛋白表达减少,细胞原有的干性特征得到逆转;而转染shβ-catenin Con的细胞与先前未转染细胞相比,干性表型无明显变化。5.NDRG1在正常结直肠粘膜上皮中的表达显著强于在肿瘤组织中的表达;NDRG1表达阳性CRC患者的术后五年生存率明显高于NDRG1表达阴性的病例。而且,NDRG1表达阳性的CRC组织多伴有核β-catenin和膜CD44的阴性表达;NDRG1表达阴性的CRC病例多伴有核β-catenin和膜CD44的强阳性表达。结论和意义:本研究从体外体内两方面证明了NDRG1基因能抑制结直肠癌细胞的干性表型,并结合临床CRC组织标本数据共同证明NDRG1可能是通过减少干性分子CD44的表达和抑制β-catenin的核转位发挥抑制作用。本研究从干性的创新角度解释了NDRG1基因抑制结直肠癌发生发展和上皮-间充质转化（EMT）的可能原因,并为NDRG1可能作为结直肠癌的诊断标志物和治疗靶点提供一定理论依据。
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