目的研究不同浓度和时间的镉暴露对小鼠卵巢颗粒细胞Kitl pre-mRNA选择性剪接的影响,观察和分析参与Kitl基因表达调控的miRNA在这一过程中的表达情况,为进一步研究镉的卵巢毒性mi RNA表观遗传调控机制提供科学依据。方法1、Kitl成熟mRNA的不同亚型检测。将提取的26日龄ICR雌性小鼠卵巢颗粒细胞进行体外培养,待细胞贴壁,形态稳定后,按照随机区组4x5裂区设计的方法进行分组,并分别加入含氯化镉的细胞培养液,进行染毒处理。主区为染镉剂量(0μM、10μM、20μM、40μM),裂区为染毒时间(0 h、2 h、4 h、6 h、8 h)。每组实验重复三次。然后通过PCR、琼脂糖凝胶电泳法检测Kitl mRNA不同亚型种类;qRT-PCR法观察各组Kitl基因成熟mRNA不同亚型的表达情况。2、参与Kitl基因表达调控的miRNA筛选与生物信息学分析。(1)使用在线预测软件http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/miRNA predicted target.html,选定miRanda、miRDB、miRWalk、Targetscan这四个数据库,对Kitl基因、以及选择性剪接重要因子hnRNP A1、hnRNP D、hnRNP L、hnRNP K/J、SR基因进行靶miRNA预测;(2)查阅相关文献,获得与Kitl基因相关的,或是与Kitl基因功能相类似的mi RNA,再与Kitl靶miRNA预测结果进行比对来进一步筛选目的mi RNA。(3)取0、10μM镉暴露4 h后的小鼠卵巢颗粒细胞,利用miRNA芯片检测细胞miRNA表达谱。使用差异倍数(FC)≥2为显著性阈值,筛选两组间的差异表达mi RNA并进行聚类分析。(4)将上述的基因靶miRNA预测结果、文献资料、芯片数据进行比对,取三者交集,来进一步确定与Kitl基因相关的miRNA,而后使用DAVID在线工具对其下游靶基因做进一步的生物信息学分析,包括基因本体(GO)分析和KEGG通路分析。3、在镉对小鼠卵巢颗粒细胞kitlpre-mrna选择性剪接影响中mmu-mir-27a-3p、mmu-mir-34b-5p、mmu-mir-297a-3p、mmu-mir-129-5p、mmu-mir-107-3p表达变化的检测。结果1、kitl成熟mrna的不同亚型表达情况。(1)染毒组与对照组一致,均只扩增出kitl1(970bp)与kitl2(886bp)两条特异性片段。kitl1、kitl2mrna的表达水平,在本实验染毒剂量下差异无统计学意义(p>0.05),而kitl1/kitl2mrna的比值差异有统计学意义(p<0.05);(2)无论kitl1、kitl2mrna的表达水平或kitl1/kitl2mrna的比值,在不同的染毒时间之间比较,差异均有统计学意义(p<0.05);且染毒时间与染毒剂量之间均存在交互作用(p<0.01)。(3)各染毒组与对照组相比,kitl1、kitl2表达水平以及kitl1/kitl2比值随时间的变化幅度和变化趋势明显不同。2、以kitl为调控目的基因的mirna筛选与生物信息学分析。(1)预测得到的kitl基因靶mirna共有470个,其中,四个数据库均能预测到(sum=4)的mirna有29个;预测得到的基因选择性剪接重要因子hnrnpa1、hnrnpd、hnrnpl、hnrnpk/j、sr基因的共同靶mirna有12个(sum≥2,取交集),其中除mmu-mir-370外,其余均为kitl的靶mirna(sum=3)。(2)根据文献资料查阅的结果,并与kitl基因靶mirna预测结果进行比对,结果发现,二者获得的mirna存在较多一致性。(3)mirna芯片结果显示,与对照组相比,mirna表达谱发生了改变。有335个mirna表达失调(fc)≥2,其中表达量升高的有191个,降低的有144个,差异倍数大于10倍的有58个;(4)将芯片结果与kitl、hnrnpa1、hnrnpd、sr基因靶mirna预测结果、文献资料的查阅结果进行比对,取交集,得到38个mirna(取sum≥3)。进一步筛除具有高度同源性的mirna,最终得到29个与kitl基因表达调控相关的mirna。其中,预测sum值≥3、文献和芯片均有较好提示的mirna有:mmu-mir-27a-3p、mmu-mir-34b-5p、mmu-mir-129-5p、mu-mir-297a-3p/mmu-mir-297b-3p/mmu-mir-297c-3p、mmu-mir-107-3p。(5)生物信息学分析go分析结果表明:这29个mirna的靶基因的功能主要富集于细胞代谢调控过程、mrna转录后调控、白介素-6介导的信号转导、细胞周期、细胞增殖分化与迁移等生物过程中;并以核酸结合调节、蛋白结合调节以及离子结合调节、actin依赖的atp酶活性、转录抑制活性等分子功能参与细胞毒性调节过程,而这些靶基因的表达产物参与了生物膜构成、大分子复合体、细胞内细胞器、膜结合细胞器以及核酸等细胞组分的构建;生物信息学分析Pathway富集分析结果显示,差异表达miRNA的靶基因主要富集于Ras信号通路、Rap1信号通路、FoxO信号通路、Hippo信号通路、MAPK信号通路、actin细胞骨架调控、干细胞信号通路调控多态性、局部附着以及致癌通路等,这些代谢通路明显紧密参与了细胞增殖生长分化、细胞凋亡调控、应激适应、炎症反应等几方面镉致细胞毒作用机制。3、与对照组比较,10μM染镉4 h组mmu-miR-27a-3p、mmu-miR-34b-5p、mmu-miR-297a-3p、mmu-miR-129-5p、mmu-miR-107-3p的表达变化趋势与芯片结果基本一致,但均未出现显著性变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论在本实验条件下:1、镉暴露影响了小鼠卵巢颗粒细胞Kitl pre-mRNA的选择性剪接,从而影响了Kitl基因的表达与调控,干扰了颗粒细胞的正常功能。2、镉暴露后小鼠卵巢颗粒细胞mi RNA表达谱出现特征性的改变;差异表达谱中,与Kitl基因表达较为值得关注的mi RNA有29个,其下游靶基因可能紧密参与了细胞增殖生长分化、细胞凋亡调控、应激适应、炎症反应等毒作用效应,这还有待扩大芯片样本量后做进一步验证。3、在本实验条件下(4 h、10μM),未发现mmu-mi R-27a-3p、mmu-miR-34b-5p、mmu-miR-297a-3p、mmu-miR-129-5p、mmu-miR-107-3p参与镉致小鼠卵巢颗粒细胞Kitl pre-mRNA选择性剪接改变的过程中。