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研究背景与目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是一个重大的公共卫生问题,全世界约有2.48亿人感染HBV,其慢性感染可导致一系列严重的肝脏疾病,包括肝纤维化(liver fibrosis),肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。HBV具有种属特异性和组织特异性,同时还具有高复制和高突变率特性,其常见的基因突变位点为基础核心启动子(Basic Core Promoter,BCP)区的1762(A1762T)和1764(G1764A)及前核心(Pre-Core,PC)区的1896(G1896A)和1899(G1899A)。体外实验或临床样本研究已发现,BCP/PC联合突变会阻断或降低HBeAg表达,然而,BCP/PC联合突变对HBV表型的更多影响尚未报道。本实验在前期BCP/PC联合突变(BCP/PC(M))小鼠模型的基础上,建立回复突变(BCP/PC(R))慢性乙型肝炎小鼠模型,通过对比分析研究BCP/PC联合突变对HBV主要标志物表型、机体免疫表型的影响,为临床诊断和探讨BCP/PC联合突变所致的表型变化机制提供了理论依据。方法1.应用分子生物学方法制备BCP/PC(R)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA),并测序鉴定。2.在HepG2细胞中转染BCP/PC(M)cccDNA和BCP/PC(R)cccDNA,ELISA实验检测HBsAg和HBeAg的分泌水平。3.通过尾静脉高压注射的方法将两种HBV cccDNA和/或生理盐水分别注射到CBA/CaJ雄性小鼠(8-10 w)体内,于指定时间点采取血清样本和小鼠肝脏组织样本。4.通过放射免疫法检测血清样本中HBsAg和HBeAg的水平。5.通过qPCR检测小鼠血清和/或肝脏组织中HBV DNA和cccDNA的水平。6.通过免疫组化检测肝脏中HBsAg和HBcAg的蛋白质水平。7.通过RT-qPCR检测肝脏中IL-1β,IL-4,IL-6和IL-10的mRNA水平。8.通过HE染色检测肝脏病理变化。9.通过统计学方法分析肝脏和血清中HBV标志物的相关性。结果1.酶切及测序结果表明BCP/PC(R)cccDNA构建成功。2.在HepG2细胞中分别转染BCP/PC(M)cccDNA和BCP/PC(R)cccDNA。BCP/PC(M)cccDNA转染后,细胞培养液上清中未检测到HBeAg,且HBsAg的水平明显低于BCP/PC(M)组(p<0.05)。3.CBA/CaJ小鼠分别注射BCP/PC(M)cccDNA和BCP/PC(R)cccDNA后,两种小鼠中HBV标志物(HBsAg,HBeAg,HBV DNA和cccDNA)均可持续表达26周以上。4.在感染早期,BCP/PC(M)组小鼠血清中HBsAg和HBV DNA的水平以及肝脏中HBV DNA和cccDNA的水平均显著低于BCP/PC(R)组(p<0.05);在整个感染期,BCP/PC(M)组小鼠血清中ALT的水平明显高于BCP/PC(R)组(p<0.05)。与BCP/PC(R)组相比,感染4周后,BCP/PC(M)组肝脏中IL-4和IL-10的mRNA水平显著降低;然而,感染26周后,BCP/PC(M)组肝脏中IL-4和IL-10的mRNA水平显著升高,IL-1β的mRNA水平显著降低。5.感染26周后,两组小鼠肝脏均出现炎性细胞浸润现象,且BCP/PC(M)组的炎性细胞浸润少于BCP/PC(R)组。6.在两组小鼠中,血清中HBV DNA的水平与肝细胞内HBV DNA和cccDNA的水平均呈显著正相关。结论1.成功回复突变构建了BCP/PC(R)cccDNA,并建立了BCP/PC(M)和BCP/PC(R)慢性乙型肝炎小鼠模型。BCP/PC(R)组小鼠血清HBeAg的表达持续阳性,两组小鼠中的HBV标志物均能稳定表达26w以上。2.BCP/PC突变导致小鼠感染早期血清及肝脏中HBV标志物水平降低,以及整个感染周期血清中ALT水平升高。3.血清中HBV DNA水平比HBsAg更好地反映肝细胞内HBV复制程度和cccDNA拷贝数。4.BCP/PC突变导致小鼠感染后期炎症反应减轻,其机制可能是在感染早期,BCP/PC突变抑制小鼠肝脏中Th2细胞因子的表达,而在感染后期,抑制Th1细胞因子的表达。