论文部分内容阅读
提高反刍动物粗饲料利用率一直是许多研究者持续关注的重要课题,解决该问题的一种有效方法就是利用纤维分解菌来提高粗饲料中粗纤维的降解率。随着基因工程技术的发展和对乳酸菌的深入研究,利用基因工程技术构建可共表达多元纤维素酶的乳酸杆菌工程菌来直接处理粗饲料,或利用其作为活菌制剂帮助动物提高其粗饲料利用率都可能是便捷、有效、廉价的方法,但是,需要特别关注重组菌的安全性问题。因此,人工重组菌构建中的无抗、有效、简便、稳定等就成为微生物基因工程技术研究中的热点。本试验通过克隆三种纤维素酶基因,筛选宿主菌乳酸菌的启动子和信号肽元件,旨在建立复杂载体的快速构建方法与技术,完善构建共表达多元纤维素酶乳酸杆菌工程菌的技术体系,并建立人工重组菌的体外评测方法,最终为功能性安全级乳酸杆菌重组菌的开发奠定基础。获得的主要研究结果如下:1.从A.fumigatus WL002 cDNA中克隆到1个内切纤维素酶基因成熟肽和1个β-葡萄糖苷酶基因成熟肽,大小分别为1434 bp和2517 bp,命名为cenA(No.KU933946)和bglW(No.KM520393);从B.subtilis WL001基因组DNA中克隆获得外/内切双功能纤维素酶基因,大小1527 bp,命名为eglS3(No.KU933947);从Streptomyces griseorubens WL003基因组DNA中克隆到1个β-葡萄糖苷酶基因,大小1203 bp,命名为bglS(No.KU921415)。获得的这4个基因均在大肠杆菌E.coil Rosseta(DE3)中能实现可溶性异源表达,经酶学性质分析发现在偏酸性条件下,重组酶CENA(pH 4.5)、EGLS3(pH 6.0-6.5)和BGLS(pH 6.0)具有最高的纤维素酶活性,而在偏碱性(pH 9.0)条件下,重组酶BGLW具有最高纤维素酶活性。因此,可以把cenA、eglS3和bglS基因用于多元纤维素酶基因的共表达乳酸杆菌工程菌的构建。2.基于POE-PCR,建立了一种简便、快速可同时将多个外源DNA片段整合到同一质粒的技术,其操作过程可在2-3天完成,大大提高了复杂载体的构建效率。而且,其质粒的阳性转化效率明显提高(>95%)。3.为了提高三个纤维素酶基因乳酸杆菌共表达质粒的基因表达水平和相应纤维素酶蛋白的胞外分泌量,将同一报告基因(celL15)和信号肽(SPusp45)一起连接到克隆载体pLEM415上,然后,从6个备选启动子中筛选出了3个作用效果理想的启动子,比较研究结果表明其作用效果是Paldo>Ppgm>PermB,且它们介导的内切葡聚糖酶活性是常用启动子P32的1.5-2倍;另外,将同一报告基因(celL15)和启动子(Paldo)一起连接到克隆载体pLEM415上,通过比较胞外纤维素酶活性,从5个备选信号肽中筛选出了3个胞外分泌效果理想的信号肽,比较研究结果表明其胞外分泌酶的活性SPlp0373>SPamyL>SPusp45,之后,又在β-葡萄糖苷酶的胞外分泌效果和酶活上进行了比较,证明信号肽SPlp0373的效果最好,可用于构建乳酸杆菌分泌表达载体。4.成功构建了3元纤维素酶基因乳酸杆菌共表达质粒pLEM415-cenA-eglS3-bglS,并获得了一个共表达三元纤维素酶的乳酸杆菌重组菌XNY/pLEM415-cenA-eglS3-bglS。该菌在正常发酵培养条件下可同时表达分泌内切葡聚糖酶、外切内切双功能纤维素酶和β-葡萄糖苷酶,其胞外重组蛋白在45-50℃和pH 5.5-6.0条件下具有较高的内切葡聚糖酶活性(1.42±0.13 U/mL/OD600)、外切葡聚糖酶活性(0.42±0.06 U/mL/OD600)、β-葡萄糖苷酶活性(0.71±0.09 U/mL/OD600)和滤纸酶活性(0.72±0.07 U/mL/OD600),表明该菌具有一定的纤维降解能力。进一步利用该工程菌株对小麦秸秆和玉米秸秆进行了固体发酵试验,结果表明在优化后的发酵条件下,小麦秸秆和玉米秸秆的粗纤维降解率分别提高了12.6%和9.7%,表明用于粗饲料体外发酵或作为活菌制剂具有一定效果。5.为完善乳酸杆菌重组技术,获得无抗标记的乳酸杆菌重组菌,本试验首次克隆了乳酸杆菌苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基编码基因pheS(No.KF915808),大小1047 bp,并证实该基因存在的一个点突变(GCC312GGC)可作为乳酸杆菌负向筛选的标记,筛选确定的底物(p-Cl-Phe)的适宜浓度为25 mM。通过把该负向筛选标记(pheSM同义突变基因pheSMn)、正向筛选标记(红霉素基因)与靶基因一起,经过两轮同源重组,建立了一种无抗标记乳酸杆菌重组技术。同时,利用该技术成功获得了一个无抗标记的纤维素酶基因重组乳酸杆菌XNY-celL15。进一步的研究表明,该重组菌可表达内切葡聚糖酶,活性为0.81 U/mL/OD600。这为开发功能性安全级乳酸杆菌提供了技术基础。