hNT-4基因修饰嗅鞘细胞结合组织工程技术治疗周围神经损伤的研究

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目的:1、研究体外高纯度Wistar乳鼠嗅鞘细胞(OECs)的培养方法;2、研究OECs与壳聚糖支架的组织相容性;3、构建组织工程人工神经桥接Wistar大鼠10mm臂丛神经缺损,研究此人工神经桥接体的修复效果及这些促神经再生因素之间的相互作用。方法:1、用差速贴壁法和化学抑制剂法进行分离培养OECs:取3-5天的Wistar乳鼠嗅球,两次差速贴壁分离培养,阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长,NGFRp75免疫组化染色计算OECs纯度;2、观察嗅鞘细胞与壳聚糖的生物相容性:将传代培养的嗅鞘细胞分别接种至壳聚糖包被的培养板(实验组)和未处理的培养板(对照组)上进行培养,应用DAPI荧光染色法检测细胞存活和增殖状况;3、将制备的组织工程化人工神经移植进行神经缺损修复实验:以臂丛神经损伤的Wistar大鼠为动物模型,实验动物随机分为4组。A组:壳聚糖导管(桥接)+hNT4-OECs组;B组:自体神经移植组;C组:壳聚糖导管(桥接)组;D组:阴性对照组。于术后6、12周,应用电生理检测、HE染色、免疫荧光染色观察嗅鞘细胞的存活、表达及周围神经结构、功能的恢复情况。结果:1、经NGFRp75免疫组织化学染色鉴定结果表明成功分离、培养OECs,细胞纯度达95%以上;2、OECs与壳聚糖支架的组织相容性:正常对照组和实验组各时点凋亡细胞的百分率经比较差异无显著性(P>0.05);3、大体观察:术后动物均出现不同程度的足底溃疡、患肢屈曲挛缩及拖曳步态,恢复情况以A、B组最好,C组次之,D组最差,6周以后有所改善,12周后大鼠处死,壳聚糖管吸收完全;4、电生理检测:A组与C组、D组神经传导速度(NCV)和神经动作电位振幅(AMP)比较均有统计学意义(P<0.05),A组、B组比较无统计学意义(P>0.05);5、组织学观察:神经损伤后12周的恢复情况明显优于6周,A组、B组神经纤维粗大、排列整齐,包裹较厚髓鞘;C组神经纤维排列稀疏呈波浪形,内可见新生毛细血管及少量胶原纤维;D组神经纤维紊乱分布,胶原组织较多。组织切片显示在12周时A组神经损伤处仍有GFP荧光表达,表明嗅鞘细胞在人工神经内仍然存活。结论:1、应用差速贴壁加化学抑制剂法可得到数量较大,纯度较高的OECs;2、壳聚糖导管具有良好生物相容性,可以作为神经桥接管;3、用壳聚糖制作三维支架,以hNT-4基因转染的OECs为种子细胞,构建成的组织工程化人工神经,修复神经缺损,其修复效果接近于自体神经移植,相对于单纯应用壳聚糖神经导管修复神经缺损可进一步提高神经修复的效果,具有广阔的应用前景,值的进一步研究。
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