空肠弯曲菌是一种非常重要的食源性致病菌,是全球范围内感染性腹泻常见的病原菌之一,同时也多种动物的共生菌。人类感染空肠弯曲菌的主要来源为被污染的水和动物性食品,如乳制品和未煮熟的肉类等。空肠弯曲菌感染常引起急性、自限性肠炎,也会导致全身感染甚至引起严重的并发症—格林巴利综合症。一旦出现严重或持久感染,或免疫力低下者感染就需要使用抗生素进行治疗。大环内酯类和氟喹诺酮类是临床常用的抗弯曲杆菌感染的药物。近年来空场弯曲杆菌对氟喹诺酮类的耐药问题日益严重,使得大环内酯类在治疗感染时显得尤为重要。其中红霉素自上个世纪70年代开始应用于肠道感染的治疗,泰乐菌素作为畜禽专用抗生素被广泛应用于兽医临床。目前的流行病学数据显示,空肠弯曲杆菌对大环内酯类耐药问题日益呈现,但是其机制尚未完全明确,适应性相关研究也刚刚起步,这对控制耐药的产生与传播非常不利。本实验室郝海红博士对不同水平红霉素耐药的空肠弯曲菌NCTC11168和81-176进行芯片分析筛选耐药菌中的差异表达基因。结果显示在这两种细菌的差异基因中有5个未知功能的基因表达模式相同,其中cj1199的表达量在NCTC11168中随耐药性增高而增高。根据NCBI搜索到的该基因的核酸和氨基酸序列进行生物信息学分析该基因是一种亚铁依赖型氧化还原酶,结合郝海红博士的网络分析结果,我们推测该基因参与了细菌体内氨基酸的合成以及细菌对外界环境的应激从而辅助了细菌对红霉素耐药性和适应性的产生。本研究选取cj1199为目的基因研究其功能及在空肠弯曲菌对红霉素耐药过程中所发挥的作用,为防止耐药性的产生和传播提供理论指导和支撑,从而保障用药的安全性和有效性。首先构建载体,采用同源重组的方法构建cj1199基因的缺失突变体；通过各种不同的表型实验分析该基因缺失对细菌本身可能会造成的影响；通过基因芯片技术进行差异基因筛选,从而深入分析该基因的功能及对耐药的影响。采取反向PCR和重叠延伸PCR两种方法进行载体的构建。反向PCR法要求先扩增cj1199及其上下游约2000bp左右的基因片段,然后连接pGEM-T easy载体。用分别携带BamH I和Sma Ⅰ酶切位点的引物进行反向PCR扩增载体全长,同时用携带有相同酶切位点的引物扩增cat基因,将产物回收后用上述两种酶进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳回收目的条带,用T4DNA lingase连接,转化大肠杆菌感受态细胞,经验证无误后扩大培养提取质粒。重叠延伸PCR法要求扩增携带有cat同源臂的cj1199上半段基因和下半段基因,然后将这两个基因与cat进行重叠延伸,得到的基因片段连接pGEM-T easy载体,转化感受态细胞,提取质粒。结果通过反向PCR法顺利获得目标载体。重叠延伸PCR法不成功。将构建好的载体与NCTC11168混匀后共同孵育,进行自然转化,将混合体系涂布于氯霉素抗性平板,筛选突变体。同时制备电转化载体细胞,加入载体混匀,2450V、200Ω、25μF条件下持续电击5sec,加入预热的SOC培养基,轻柔混匀,涂布含有氯霉素抗性的MH琼脂平板,筛选突变体。结果显示电转化和自然转化都成功获得插入缺失突变体,经PCR及测序方法进行验证无误。以母源标准菌为对照组用基因芯片技术筛选缺失突变体中差异表达的基因。采用Real-time RT-PCR的方法对结果进行验证。设置四组生物学重复,经SAM分析后总共筛选得到23个差异基因。其中2个基因上调表达,都与转运相关；21个基因下调表达,有6个转运相关基因,分别参与了天冬氨酸／谷氨酸以及铁的转运；5个氨基酸生物合成相关基因,参与了亮氨酸和色氨酸的生物合成；5个为细胞表面结构,其中有两个与铁刺激相关；2个假定蛋白,其余3个难以归类。根据差异片段功能推测：cj1199基因影响了亮氨酸的生物合成,进而影响了抗性短肽的合成,对红霉素用药初期细菌的存活做出了贡献,使得细菌产生主要耐药机制的几率增加；该基因还影响了天冬氨酸／谷氨酸的转运,影响了细菌的能量及碳的供应,对细菌在肠道内的定殖和生长做出了贡献。随后进行了一系列的表型检测。测定突变体的生长力、竞争生长力、在红霉素中的竞争生长力以及在亮氨酸缺失培养基中的生长力,与母源标准菌相比,突变体的生长力没有明显变化,但竞争生长力明显下降,在红霉素中的竞争生长力下降更为明显。在亮氨酸缺失培养基中突变体的生长力明显低于完全培养基中的生长力,也低于相同培养基中标准菌的生长力。测定突变体对不同药物的耐药性,发现两种细菌没有明显区别；采用流式细胞术(FCM)检测红霉素作用下突变体的通透性,发现高于母源标准菌的通透性,推测突变体对红霉素的耐受性降低。用红霉素诱导耐药,发现突变体表现为较难诱导、较难获得高水平耐药菌株。综上所述,本研究成功构建了用于空肠弯曲菌基因敲除的载体,运用同源重组的方法成功构建缺失突变体,并对突变体进行了差异基因的筛选和相关表型测试。突变体在各种竞争的环境中都表现出了较弱的竞争力,且细胞通透性增高,难以产生耐药菌株。说明在临床条件下突变体很快会被其他优势菌群替代,尤其是在红霉素药物作用情况下该菌株竞争生长处于弱势的同时产生耐药风险也明显降低。据差异基因功能推测,cj1199基因影响到了亮氨酸的合成、肠道中氨基酸的利用等过程,进而影响了抗性短肽的合成和细菌的能量及碳的供应,对红霉素用药初期细菌的存活以及细菌在肠道内的定殖和生长有贡献。本课题为空肠弯曲菌红霉素耐药研究提供新的科学依据,为完善耐药机制拓宽了思路,为临床药物的研发及应用提供了参考。