肺癌是仅次于乳腺癌的高发恶性肿瘤,也是全球癌症死亡的首要原因。为了克服影像学筛查在早期诊断中的技术局限性,液体活检已经成为肺癌诊断领域关注的新发展方向,而肺癌外泌体是其中颇具潜力的生物标志物之一。研发准确且灵敏的肺癌外泌体分析新方法对于提高肺癌早期诊断的准确性和及时性具有重要的意义。核酸扩增反应是分子生物学中常用的体外扩增技术,凭借其高扩增能力与和高灵敏性的电化学检测技术结合,可以显著提升肿瘤外泌体电化学检测的灵敏性。引物交换反应是近年来新兴的核酸扩增技术,其以DNA催化发夹作为模板促发DNA循环扩增反应,可以在短时间内产生大量的特定DNA产物。因此,在本论文中,我们以引物交换反应为基础,结合成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas12a）催化的循环切割反应,显著提升了电化学检测信号并依此提出了两种肺癌外泌体定量分析的新方法。主要工作内容如下:1.基于引物交换反应的PD-L1阳性肺癌外泌体电化学分析新方法研究非小细胞肺癌是肺癌中最为常见的类型之一,占所有肺癌病例的80%以上。肺癌外泌体表面的程序性死亡配体1（PD-L1）因为可以抑制T细胞的活性,与非小细胞肺癌的病程进展密切相关,因此,PD-L1阳性的肺癌外泌体成为了一类新兴的肺癌液体活检标志物,用于非小细胞肺癌患者的早期诊断和实时监测。在这部分工作中,PD-L1阳性的肺癌外泌体首先被PD-L1抗体功能化的磁珠捕获,其后,进一步结合胆固醇功能化的催化发夹DNA,引发级联信号放大反应。级联信号放大反应从催化发夹DNA触发的引物交换反应开始,其产生的大量延伸产物可以激活Cas12a蛋白的反式切割活性。随后,Cas12a催化的随机切割反应促发了亚甲基蓝标记的DNA信号链降解反应,释放了其末端具有电活性的亚甲基蓝分子。最后,游离的亚甲基蓝分子被富集到葫芦[7]脲功能化的石墨电极表面,产生适用于PD-L1阳性肺癌外泌体定量分析的电化学信号。电化学分析结果表明,该方法在PD-L1阳性肺癌外泌体分析方面具有较高的灵敏度和特异性,线性检测范围为10~3至10~9个外泌体/毫升,检测限低至708个外泌体/毫升。同时,此方法能够在临床血清样本中有效检测PD-L1阳性的肺癌外泌体的水平变化,而且获得的电化学信号强度与肺癌病程发展呈正相关,有望用于监测非小细胞肺癌患者的病程发展。2.引物交换反应辅助的肺癌外泌体双信号电化学分析新方法研究液体活检作为一种无创或微创的非侵入疾病诊断手段,可以在一定条件下提高疾病诊断的准确率。然而,由于外泌体分泌可能受到生理或病理环境中各种因素的影响,肺癌外泌体的分泌水平存在个体差异,因而外泌体液体活检在肺癌精准诊断中可能有所局限。在这部分工作中,我们制备了两种DNA探针:一种是胆固醇修饰的DNA探针,其可以通过疏水作用插入外泌体膜;另一种是与PD-L1抗体连接的核酸-抗体探针,其可以通过特异性免疫识别与外泌体表面的PD-L1结合。同时,通过使用两种量子点（如Cd S和Pb S）分别标记DNA探针并富集相应的DNA产物,可以产生对应于总外泌体量和外泌体PD-L1水平的电化学双信号。借助电化学信号的比值可以表征外泌体分泌的个体差异,从而更加准确地在外泌体水平反映PD-L1表达状况,进一步提高肺癌患者早期筛查和分期的有效性。电化学分析结果表明,该方法可以在较宽外泌体浓度范围(10~3至1010个外泌体/毫升)检测肺癌外泌体。当用于分析肺癌患者的临床样品时,电化学比值信号在肺癌早期筛查和分期方面表现出更好的评估准确性。