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紧张性不动(Tonic immobility,TI),是动物面对外界强烈刺激时因恐惧而呈现出全身不动的一种状态,根据TI持续时间可以分为短TI(STI)和长TI(LTI)两种反应表型。下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴控制着反应激素的合成与释放,对TI持续时间有显著影响。在正常和应激状态下,不同TI表型肉鸡的生长性能和福利状况存在差异,STI表型肉鸡要优于LTI表型肉鸡。我们以往的研究表明,长期低剂量皮质酮(Corticosterone,CORT)处理可抑制肉鸡胸肌的生长发育。慢性皮质酮处理主要通过增加机体氧化应激损伤,而TI影响肌肉生长可能与糖代谢水平不同有关。肌肉蛋白质代谢水平是决定肌肉生长的重要环节,本实验在前期研究基础上,从骨骼肌蛋白质代谢和能量代谢角度,进一步研究慢性应激和TI影响骨骼肌生长的机制。此外,探索了慢性CORT应激对肉鸡胆固醇代谢的影响及机理,为研究肉鸡福利和肌肉品质提供参考资料。1 慢性CORT处理对不同TI表型肉鸡胸肌蛋白质代谢的影响根据TI的持续时间长短不同,将肉鸡分成STI和LTI组。从27日龄开始,在饮水中添加CORT(5mg/L)并连续处理15 d,以模拟慢性应激时体内的CORT水平,于42日龄时结束实验。前期研究资料表明,CORT和LTI表型显著降低肉鸡体重和胸肌/体重比。为了研究LTI型和慢性CORT处理抑制胸肌生长的机制,我们检测了蛋白质合成通路以及蛋白质降解关键基因mRNA水平。结果显示,TI和CORT对蛋白质合成通路Akt/mTOR/p70s6k以及蛋白质降解的关键基因Atrogin-1和MuRF1均没有显著影响(p>0.05)。但Western blot结果显示,LTI肉鸡胸肌中Akt(p=0.05)和p-Akt(p=0.06)比STI肉鸡高;与对照组相比,慢性CORT处理组肉鸡胸肌中总Akt(p=0.09)和p70s6k(p=0.08)蛋白有降低的趋势。提示LTI和CORT影响肉鸡骨骼肌的生长可能不是主要通过依赖mTOR的信号通路,但对蛋白质降解途径的影响仍需进一步研究。2 慢性CORT处理对不同TI表型肉鸡胸肌能量代谢的影响对于鸟类的胸肌,糖酵解途径可以提供能量供肌肉收缩和生长发育。我们以往研究显示LTI表型和皮质酮处理导致肌肉糖酵解效率降低,从而抑制了肌肉的生长和发育。因此我们猜想LTI和CORT引起了肉鸡骨骼肌能量储存和代谢的改变。通过检测胸肌和肝脏糖元含量,用高压液相的方法检测胸肌中ATP的含量以研究慢性CORT处理对不同TI表型肉鸡肌肉能量储存状态的影响。结果显示,STI肉鸡胸肌ATP含量(p<0.05),能荷(Energy charge,EC)(p<0.01)和肌糖元含量(p<0.05)显著高于LTI表型。但是LTI肉鸡胸肌的ADP含量(p=0.08)有高于STI表型肉鸡的趋势。慢性CORT处理显著降低肝糖原的含量(p<0.05),但是显著升高胸肌中的EC(p<0.05)。Real-time PCR 测定结果表明 STI 肉鸡胸肌中 PPARα(p = 0.06)和AMPKα(p = 0.09)mRNA的表达有高于LTI表型的趋势。慢性CORT处理显著降低了胸肌糖酵解基因α-enolase(p<0.05)的表达。提示:LTI表型和慢性CORT处理对胸肌能量储存产生显著影响。线粒体的氧化磷酸化对能量稳态至关重要。对线粒体能量代谢相关指标进行测定。结果显示,STI表型肉鸡胸肌的mtDNA拷贝数和细胞色素c氧化酶活力均高于LTI(p<0.05)。用Real-time PCR方法检测了mtDNA编码的氧化磷酸化基因的表达,发现COX1、COX2、NADH脱氢亚基1、3和6在STI表型肉鸡的胸肌中表达高于LTI型(p<0.05)。但线粒体调控区启动子的甲基化活性在TI和CORT组并没有显著改变(p>0.05)。PGC-1α蛋白对线粒体的生物合成起主要调控作用,在STI表型肉鸡中表达高于LTI表型(p<0.05)。但是,TI和CORT不影响位于线粒体内膜参与质子传递的avUCP蛋白表达(p>0.05)。以上结果提示STI肉鸡胸肌的线粒体功能比LTI强。而慢性CORT处理不改变线粒体代谢,提示线粒体对低剂量外源性CORT处理敏感性较弱。3慢性CORT处理肉鸡胸肌、肝脏胆固醇代谢的影响哺乳动物长期处于内源性糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)浓度过高的状态容易引起代谢紊乱症和脂质代谢紊乱,表现为血液中甘油三酯的增加和总胆固醇水平的升高。然而,慢性CORT处理对肉鸡胆固醇代谢的影响尚未见报道。本研究发现,慢性CORT处理极显著增加了胸肌(p<0.001)、腿肌(p<0.01)和肝脏(p<0.05)中总胆固醇的水平,同时慢性CORT处理增加了胸肌(p<0.001)、肝脏(p=0.06)中总甘油三酯的含量。CORT处理显著上调胸肌组织中HMGCR(p<0.05)的mRNA表达,11P-HSD1转录水平表达有下调的趋势(p=0.08),但是不影响GR,11β-HSD2,CYP7A1,CYP27A1,ApoB 和 LDLR 转录水平的表达(p>0.05)。此外,慢性 CORT处理对肝脏组织CYP7A1(p=0.07)和ABCA1(p=0.06)在mRNA水平有下调的趋势。Western blot结果显示,与对照组相比,CORT处理显著增加核蛋白GR、HMGCR和 LDLR(p<0.05)的蛋白含量,对肌细胞全蛋白GR(p=0.08)、ApoA1(p=0.06)、11β-HSD2(p=0.07)有增加趋势。此外,慢性CORT处理显著增加肝脏组织GR、11β-HSD2、LDLR(p<0.05)的蛋白水平,但是对HMGCR(p=0.06)的蛋白含量有下调趋势。以上结果表明,慢性CORT处理引起肉鸡胸肌组织胆固醇的沉积,其机制可能与肌细胞内合成胆固醇增加和摄取增加有关。而CORT诱导肉鸡肝脏胆固醇增加可能与转运增加、输出减少有关。