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第一部分髌韧带短缩低位髌骨模型的建立及其对髌股关节退变影响的实验研究
目的：本研究拟对大鼠进行髌韧带短缩(patellar ligaments shortening, PLS)手术诱导低位髌骨，通过影像学和组织学观察并探讨低位髌骨对髌股关节退变的情况及其病理特点，并为药物干预髌股关节炎(patellofemoral joint osteoarthritis，PFJOA)建立动物模型。
方法：将16只三月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为2组(n=8)，即：假手术组(Sham组)与髌韧带短缩组(PLS组)。PLS组行髌韧带短缩手术，通过在右侧膝关节髌韧带下方插入一根长7mm,直径2mm，距两侧末端1mm处各有凹槽并系带1-0尼龙缝线的克氏针，结扎髌韧带诱导低位髌骨。Sham组进行对照性手术，不进行实质性韧带短缩。韧带短缩10周后，先进行X-ray扫描观察低位髌骨情况并进行影像学评分。再安乐死动物并获取右侧PFJ，大体观察后进行标本固定，再对标本进行micro-computedtomography(micro-CT)检测后，脱钙，包埋切片处理。使用HE、番红-O-固绿染色观察PFJ退变情况，采用Mankin、OARSI评分系统评估PFJ软骨及软组织退变情况。免疫组化学染色检测II型胶原(collagen type II, Col-II)，基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)，信号转导和转录激活因子-3(signal transducer and activator oftranscription3,Stat3)，组织蛋白酶K(cathepsin k, CTSK)和骨保护素(osteoprotegerin, OPG)。TUNEL染色检测软骨细胞凋亡。
结果：
1髌骨位置与结构
1.1影像学结果显示：PLS组大鼠克氏针保持完整，无脱落现象，并且与Sham组相比，PLS组大鼠modifiedInsall-Salvati(MIS)比值显著降低(P＜0.001)，PLS手术成功建立了大鼠低位髌骨模型，同时，髌骨横截面积与矢状长度均显著增加(P＜0.05)。
2PFJ退变情况
2.1软骨退变大体观察结果显示：PLS组大鼠关节软骨面粗糙，色泽暗淡，软骨侵蚀显著，主要集中在髌骨下极与滑车负重区；Sham组关节软骨表面光滑，无色泽改变，未见软骨侵蚀。PLS组软骨退变大体评分显著高于Sham组(P＜0.01)。
2.2软组织HE染色结果显示：PLS组大鼠呈轻度滑膜炎，滑膜细胞增生以及炎性细胞浸润，同时伴有髌下脂肪垫脂肪细胞坏死、丢失，以及广泛纤维组织增生；Sham组滑膜与髌下脂肪垫正常。PLS组滑膜OARSI评分显著高于Sham组(P＜0.05)。PLS组髌下脂肪垫脂肪细胞面积显著低于Sham组(P＜0.001)。
2.3软骨番红-O-固绿染色结果显示：PLS组大鼠滑车负重区软骨糜烂、伴纤维组织增生；非负重区软骨表面不规则；髌骨软骨表现为纤维化、肿胀、水平裂隙与软骨剥蚀。Sham组大鼠软骨大致正常，仅出现轻度的基质染色丢失。PLS组软骨退变OARSI评分均显著高于Sham组(P＜0.01)。
2.4软骨TUNEL染色结果显示：PLS组凋亡软骨细胞数量均显著高于Sham组(P＜0.001)。
2.5软骨及软骨下骨免疫组化学染色结果显示，PLS组软骨中Col-II表达水平显著低于Sham组(P＜0.05)，MMP-3与Stat3表达水平均显著高于Sham组(P＜0.05)；软骨下骨中OPG表达水平显著低于Sham组(P＜0.01)，CTSK表达水平显著高于Sham组(P＜0.01)。
2.6软骨下骨Micro-ct检测结果(滑车与髌骨)显示：与Sham组相比，PLS组大鼠的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均显著降低(P＜0.01)，而Tb.Sp、Tbpf、DA与SMI均显著增加(P＜0.01)。
第二部分雷洛昔芬对卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变潜在作用的研究
目的：本研究拟对卵巢切除(ovariectomy, OVX)大鼠进行髌韧带短缩手术，观察雌激素缺乏对大鼠低位髌骨诱导的髌股关节退变的影响，同时给予抗骨质疏松药物雷洛昔芬(raloxifene, RAL)干预，探讨RAL对卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变的作用。
方法：将60只三月龄雌性SD大鼠随机分为5组(n=12)：Sham组、OVX组、PLS组、PLS+OVX组与PLS+OVX+RAL组。对大鼠分别行双侧卵巢切除(OVX组)、髌韧带短缩手术(PLS组)、髌韧带短缩+双侧卵巢切除(PLS+OVX与PLS+OVX+RAL组)与假手术(Sham组)。髌韧带短缩术后72小时，PLS+OVX+RAL组大鼠经灌胃给予RAL干预，剂量10mg/kg/day，其余各组大鼠经灌胃给予等体积生理盐水，大鼠于术前(0天)与手术后每周测量体重并相应调整药物剂量，同时使用vonFrey纤维丝进行疼痛行为学检测。RAL干预10周后进行X-ray扫描观察低位髌骨情况并进行影像学评分。再安乐死动物并获取右侧PFJ，此时各组分为两个亚组，分别用于大体观察(n=6)与micro-CT检测(n=6)，其余标本进行固定、脱钙，包埋切片处理用于组织学观察(n=6)。使用HE与甲苯胺蓝染色观察PFJ退变情况，采用Mankin、OARSI评分系统评估PFJ软骨及软组织退变情况。
结果：
1髌骨位置与结构
1.1影像学结果显示：PLS、PLS+OVX与PLS+OVX+RAL组大鼠大鼠克氏针保持完整，无脱落，并且髌骨位置降低。PLS与PLS+OVX组Insall-Salvati(IS)比值分别显著低于Sham组与OVX组(P＜0.001)。PLS组髌骨横截面积显著高于Sham组(P=0.041,2700μm;P=0.007,4500μm)，PLS+OVX组髌骨横截面积显著高于PLS组(P=0.045,900μm;P=0.011,4500μm)，OVX组髌骨横截面积显著高于Sham组:(P=0.039,900μm)。PLS+OVX+RAL组髌骨横截面积显著低于PLS+OVX组(P=0.031,4500μm)。
2机械性异常疼痛结果
2.1各组大鼠在第0天时缩足反射阈值正常，且Sham组大鼠在整个研究过程中未出现显著变化。与手术前相比，所有PLS手术大鼠在第4周开始出现缩足反射阈值均显著降低(P＜0.05)，并随时间呈负相关变化。术后第4,6,8和10周，PLS组与PLS+OVX组50％PWT均显著低于Sham组(P＜0.01)，PLS+OVX组50％PWT均显著低于OVX组(P＜0.01)。术后第8周时，OVX加剧了大鼠缩足反射阈值的下降，PLS+OVX组50％PWT显著低于PLS组(P=0.033)。从术后第4周开始，与PLS+OVX组相比，PLS+OVX+RAL组50％PWT呈增加趋势，但是二组无统计学差异(P＞0.05)。
3PFJ退变结果
3.1软组织HE染色结果显示：PLS手术大鼠滑膜与髌下脂肪垫明显损伤，主要表现滑膜下组织广泛增殖，炎性细胞浸润，纤维增生明显；髌下脂肪垫中滑膜下组织出现广泛的血管化，大量的脂肪细胞坏死、丢失，并且被增生的纤维组织分离。Sham组与OVX组滑膜与髌下脂肪垫正常，未见炎性细胞浸润、纤维化与组织坏死。PLS组滑膜OARSI评分与髌下脂肪垫组织学评分均显著高于Sham组(滑膜与脂肪垫：P=0.01)，PLS+OVX组均显著高于OVX组(滑膜：P=0.034;脂肪垫：P=0.025)。
3.2软骨大体观察结果显示：Sham组与OVX组大鼠关节软骨表面光滑透明，无色泽改变，未见软骨侵蚀。PLS组、PLS+OVX组与PLS+OVX+RAL组滑车与髌骨软骨均表面粗糙，色泽暗淡，可见大面积软骨侵蚀，关节面边缘有骨赘形成。但是在PLS+OVX组软骨损伤最为严重，可见软骨侵蚀延伸到软骨下骨区域，伴有大面积软骨下骨暴露。PLS组软骨退变大体评分显著高于Sham组(P=0.038)，PLS+OVX组软骨退变大体评分均显著高于PLS组与PLS+OVX+RAL组(P=0.015)。
3.3软骨甲苯胺蓝染色结果显示：PLS组与PLS+OVX组大鼠关节软骨软骨细胞数量显著减少，只剩部分深层软骨细胞；表层软骨肿胀并出现水平裂隙伴软骨剥脱。软骨退变在PLS+OVX组最为显著，大面积软骨缺损，被大量增生的软组织填充，并有血管侵入。PLS+OVX+RAL组大鼠表现为表层软骨细胞数量轻度下降，细胞克隆，呈簇集样改变；软骨基质染色轻度降低，轻微肿胀并伴局部软骨缺损，软骨退变得到显著缓解。OVX组大鼠关节软骨仅出现轻度的基质染色下降与表层软骨细胞轻度增多。Sham组大鼠关节软骨大致正常。Mankin组织学评分显示：PLS组大鼠显著高于Sham组(P＜0.001)；PLS+OVX组显著高于PLS组(P＜0.001)；PLS+OVX+RAL组显著低于PLS+OVX组(P＜0.001)。
3.4Micro-CT检测结果(滑车与髌骨)显示：OVX组，PLS组与PLS+OVX组大鼠软骨下骨均出现骨量减少，骨小梁数量、厚度降低，骨小梁间距增加，板状骨小梁减少，而棒状骨小梁增加。OVX加剧了PLS诱导的骨量丢失与结构的恶化，以PLS+OVX组最为明显。PLS+OVX+RAL组大鼠治疗后软骨下骨骨量增加，结构得到显著改善。PLS组大鼠软骨下骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著低于Sham组(P＜0.01)，而Tb.Sp与SMI均显著高于Sham组(P＜0.01)；PLS+OVX组大鼠软骨下骨BMD、BV/TV、Tb.N显著低于PLS组(P＜0.05)，而Tb.Sp与SMI均显著高于PLS组(P＜0.05)；PLS+OVX+RAL组大鼠软骨下骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著高于PLS+OVX组(P＜0.05)，而Tb.Sp与SMI均显著低于PLS+OVX组(P＜0.001)。
第三部分雷洛昔芬延缓卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变作用机制的研究
目的：本研究基于RAL可以延缓卵巢切除大鼠髌股关节退变，但其作用机制尚未阐述，拟应用卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变模型，早期经灌胃给予RAL干预，进一步探讨RAL对卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变的作用机制。
方法：将30只三月龄雌性SD大鼠随机分为5组(n=6)：Sham组、OVX组、PLS组、PLS+OVX组与PLS+OVX+RAL组。对大鼠分别行双侧卵巢切除(OVX组)、髌韧带短缩手术(PLS组)、髌韧带短缩+双侧卵巢切除(PLS+OVX与PLS+OVX+RAL组)与假手术(Sham组)。髌韧带短缩手术后72小时PLS+OVX+RAL组大鼠经灌胃给予RAL干预，剂量10mg/kg/day，其余各组大鼠经灌胃给予等体积生理盐水，大鼠于术前与手术后每周测量体重并相应调整药物剂量。RAL干预10周后进行X-ray扫描观察低位髌骨情况并进行影像学评分。经腹主动脉取血(5-8ml)处死所有大鼠，4℃离心取上层血清2ml置于-80℃环境保存，用于测定骨代谢标记物。同时获取右侧PFJ标本，置于10%福尔马林溶液中固定保存，用于软骨组织学检测与免疫组织化学检测PFJ软骨中II型胶原(collagen type II, Col-II)，基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-3, MMP-13)，聚集蛋白聚糖(aggrecan, AGG),血小板型金属蛋白酶4(metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4)与Caspase-3。甲苯胺蓝染色观察PFJ软骨退变并采用Mankin评分系统进行组织学评分。抗酒石酸磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色检测软骨下骨中破骨细胞数量，采用染色酶联免疫吸附测定试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测血清中骨钙塑(Osteocalcin,OCN)与一型胶原C端肽(C-telopeptide of type I collagen,CTX-I)的水平。
结果：
1.影像学结果
1.1影像学结果显示：PLS、PLS+OVX与PLS+OVX+RAL组大鼠大鼠克氏针保持完整，无脱落。PLS组IS比值(1.97±0.20)显著低于Sham组(2.41±0.25)(P＜0.01)，PLS+OVX组IS比值(1.96±0.15)显著低于OVX组(2.34±0.31)(P＜0.05)。
2.关节软骨退变结果
2.1软骨甲苯胺蓝染色结果显示，PLS组、PLS+OVX组大鼠滑车负重区软骨中基质染色严重减少，表面出现裂隙延伸至软骨下骨大面积软骨剥脱伴纤维组织增生、填充，潮线不齐伴有血管交叉侵入；非负重区主要表现为基质染色轻度降低，软骨细胞克隆，呈簇集样改变。髌骨整个区域表现为表层软骨细胞数量显著减少，只剩部分深层软骨细胞；软骨基质染色严重减少，肿胀并出现水平裂隙伴软骨剥脱，软骨退变在PLS+OVX组最为显著。PLS+OVX+RAL组大鼠滑车负重区软骨基质染色轻度下降，裂隙未达软骨下骨，轻度软骨缺损，潮线整齐；非负重区软骨基质染色正常，软骨细胞数量轻度增多。髌骨整个区域表现为表层软骨细胞数量轻度下降，细胞克隆，呈簇集样改变；软骨基质染色轻度降低，轻微肿胀并，局部软骨剥脱，软骨退变得到显著改善。OVX组大鼠关节软骨仅出现轻度的基质染色下降与表层软骨细胞轻度增多。Mankin组织学评分显示：两侧负重区(内侧、外侧)：PLS组大鼠显著高于Sham组(滑车：P=0.039,P=0.002;髌骨：P=0.002,P=0.033)；PLS+OVX组显著高于PLS组(滑车：P=0.009,P=0.041;髌骨：P=0.026,P=0.041)；PLS+OVX+RAL组显著低于PLS+OVX组(髌骨：P=0.026,P=0.015)。非负重区：PLS组大鼠显著高于Sham组(滑车：P=0.009;髌骨：P=0.002)；PLS+OVX组显著高于PLS组(滑车：P=0.009;髌骨：P=0.004)；PLS+OVX+RAL组显著低于PLS+OVX组(滑车：P=0.041;髌骨：P=0.004)。
2.2滑车与髌骨软骨(负重区、非负重区)免疫组织化学染色结果显示：Sham组Col-II表达水平显著高于OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05负重区)、PLS组(滑车：P＜0.05,负重区;髌骨：P＜0.05)与PLS+OVX组(滑车：P＜0.01,负重区;髌骨：P＜0.01)。PLS+OVX+RAL组Col-II表达水平显著高于PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05负重区)。
Sham组MMP-13表达水平显著低于OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05非负重区)、PLS组(滑车：P＜0.01;髌骨：P＜0.05外侧负重区除外)与PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.01)。PLS+OVX组MMP-13表达均显著高于OVX组(滑车：P＜0.001外侧负重区除外；髌骨：P＜0.05)与PLS组(滑车：P＜0.05外侧负重区；髌骨：P＜0.05非负重区除外)。PLS+OVX+RAL组MMP-13表达水平显著低于PLS+OVX组(滑车：P＜0.01内侧负重区除外、髌骨：P＜0.01)。
Sham组AGG表达水平显著高于OVX组(滑车：P＜0.05内侧负重区)、PLS组(滑车：P＜0.05;髌骨：P＜0.05外侧负重区除外)与PLS+OVX组(滑车：P＜0.05;髌骨：P＜0.01外侧负重区除外)。PLS+OVX+RAL组AGG表达水平显著高于PLS+OVX组(滑车：P＜0.05，负重区；髌骨：P＜0.05非负重区)。
Sham组ADAMTS-4表达水平显著低于PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05)。PLS+OVX组ADAMTS-4表达水平均显著高于OVX组(滑车：P＜0.01外侧负重区除外；髌骨：P＜0.05)与PLS组(滑车：P＜0.01外侧负重区除外；髌骨：P＜0.01内侧负重区与非负重区除外)。PLS+OVX+RAL组ADAMTS-4表达水平显著低于PLS+OVX组(P＜0.001外侧负重区除外；髌骨：P＜0.05非负重区除外)。
Sham组Caspase-3表达水平显著低于PLS组(滑车：P＜0.05外侧负重区除外；髌骨：P＜0.05)与PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.01)。PLS+OVX组Caspase-3表达水平均显著高于OVX组(滑车、髌骨：P＜0.01)与PLS组(滑车、髌骨：P＜0.05)。PLS+OVX+RAL组Caspase-3表达水平显著低于PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05)。
3.软骨下骨代谢结果
3.1TRAP染色结果显示：OVX组,PLS组与PLS+OVX组大鼠软骨下骨中破骨细胞数量显著高于Sham组(P＜0.05)。PLS+OVX组软骨下骨中破骨细胞数量显著高于PLS组(P＜0.05)。RAL干预后，PLS+OVX+RAL组软骨下骨中破骨细胞数量显著低于PLS+OVX组(P＜0.05)。
3.2血清骨转换标记物水平结果显示：OVX组,PLS组与PLS+OVX组大鼠血清中OCN与CTX-I水平均显著高于Sham组(P＜0.05)。PLS+OVX组血清中OCN与CTX-I水平均显著高于PLS组(P＜0.05)。RAL干预后，PLS+OVX+RAL组血清中OCN与CTX-I水平均显著低于PLS+OVX组(P＜0.05)。
结论：
1.髌韧带短缩可导致SD大鼠髌股关节出现低位髌骨，进而导致大鼠在术后10周内PFJ软骨出现退行性改变，软骨下骨微结构恶化以及周围软组织明显损伤，该模型对阐述PFJ早期OA病理改变以及为后续药物干预提供了良好的模型基础。
2.雌激素缺乏可加重PFJ关节软骨以及软骨下骨退变，降低大鼠疼痛敏感阈值，提示雌激素缺乏是PFJOA的风险因素；同时，早期给予RAL干预可有效延缓PFJ软骨退变，增加软骨下骨骨密度以及维持微结构的稳定性，提示RAL是一种潜在的PFJOA修饰药物。
3.RAL对关节软骨以及软骨下骨具有双重的保护作用，可能通过改善软骨代谢以及抑制软骨下骨异常的骨转换，进而延缓PFJOA的病理进展。
目的：本研究拟对大鼠进行髌韧带短缩(patellar ligaments shortening, PLS)手术诱导低位髌骨，通过影像学和组织学观察并探讨低位髌骨对髌股关节退变的情况及其病理特点，并为药物干预髌股关节炎(patellofemoral joint osteoarthritis，PFJOA)建立动物模型。
方法：将16只三月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为2组(n=8)，即：假手术组(Sham组)与髌韧带短缩组(PLS组)。PLS组行髌韧带短缩手术，通过在右侧膝关节髌韧带下方插入一根长7mm,直径2mm，距两侧末端1mm处各有凹槽并系带1-0尼龙缝线的克氏针，结扎髌韧带诱导低位髌骨。Sham组进行对照性手术，不进行实质性韧带短缩。韧带短缩10周后，先进行X-ray扫描观察低位髌骨情况并进行影像学评分。再安乐死动物并获取右侧PFJ，大体观察后进行标本固定，再对标本进行micro-computedtomography(micro-CT)检测后，脱钙，包埋切片处理。使用HE、番红-O-固绿染色观察PFJ退变情况，采用Mankin、OARSI评分系统评估PFJ软骨及软组织退变情况。免疫组化学染色检测II型胶原(collagen type II, Col-II)，基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)，信号转导和转录激活因子-3(signal transducer and activator oftranscription3,Stat3)，组织蛋白酶K(cathepsin k, CTSK)和骨保护素(osteoprotegerin, OPG)。TUNEL染色检测软骨细胞凋亡。
结果：
1髌骨位置与结构
1.1影像学结果显示：PLS组大鼠克氏针保持完整，无脱落现象，并且与Sham组相比，PLS组大鼠modifiedInsall-Salvati(MIS)比值显著降低(P＜0.001)，PLS手术成功建立了大鼠低位髌骨模型，同时，髌骨横截面积与矢状长度均显著增加(P＜0.05)。
2PFJ退变情况
2.1软骨退变大体观察结果显示：PLS组大鼠关节软骨面粗糙，色泽暗淡，软骨侵蚀显著，主要集中在髌骨下极与滑车负重区；Sham组关节软骨表面光滑，无色泽改变，未见软骨侵蚀。PLS组软骨退变大体评分显著高于Sham组(P＜0.01)。
2.2软组织HE染色结果显示：PLS组大鼠呈轻度滑膜炎，滑膜细胞增生以及炎性细胞浸润，同时伴有髌下脂肪垫脂肪细胞坏死、丢失，以及广泛纤维组织增生；Sham组滑膜与髌下脂肪垫正常。PLS组滑膜OARSI评分显著高于Sham组(P＜0.05)。PLS组髌下脂肪垫脂肪细胞面积显著低于Sham组(P＜0.001)。
2.3软骨番红-O-固绿染色结果显示：PLS组大鼠滑车负重区软骨糜烂、伴纤维组织增生；非负重区软骨表面不规则；髌骨软骨表现为纤维化、肿胀、水平裂隙与软骨剥蚀。Sham组大鼠软骨大致正常，仅出现轻度的基质染色丢失。PLS组软骨退变OARSI评分均显著高于Sham组(P＜0.01)。
2.4软骨TUNEL染色结果显示：PLS组凋亡软骨细胞数量均显著高于Sham组(P＜0.001)。
2.5软骨及软骨下骨免疫组化学染色结果显示，PLS组软骨中Col-II表达水平显著低于Sham组(P＜0.05)，MMP-3与Stat3表达水平均显著高于Sham组(P＜0.05)；软骨下骨中OPG表达水平显著低于Sham组(P＜0.01)，CTSK表达水平显著高于Sham组(P＜0.01)。
2.6软骨下骨Micro-ct检测结果(滑车与髌骨)显示：与Sham组相比，PLS组大鼠的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均显著降低(P＜0.01)，而Tb.Sp、Tbpf、DA与SMI均显著增加(P＜0.01)。
第二部分雷洛昔芬对卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变潜在作用的研究
目的：本研究拟对卵巢切除(ovariectomy, OVX)大鼠进行髌韧带短缩手术，观察雌激素缺乏对大鼠低位髌骨诱导的髌股关节退变的影响，同时给予抗骨质疏松药物雷洛昔芬(raloxifene, RAL)干预，探讨RAL对卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变的作用。
方法：将60只三月龄雌性SD大鼠随机分为5组(n=12)：Sham组、OVX组、PLS组、PLS+OVX组与PLS+OVX+RAL组。对大鼠分别行双侧卵巢切除(OVX组)、髌韧带短缩手术(PLS组)、髌韧带短缩+双侧卵巢切除(PLS+OVX与PLS+OVX+RAL组)与假手术(Sham组)。髌韧带短缩术后72小时，PLS+OVX+RAL组大鼠经灌胃给予RAL干预，剂量10mg/kg/day，其余各组大鼠经灌胃给予等体积生理盐水，大鼠于术前(0天)与手术后每周测量体重并相应调整药物剂量，同时使用vonFrey纤维丝进行疼痛行为学检测。RAL干预10周后进行X-ray扫描观察低位髌骨情况并进行影像学评分。再安乐死动物并获取右侧PFJ，此时各组分为两个亚组，分别用于大体观察(n=6)与micro-CT检测(n=6)，其余标本进行固定、脱钙，包埋切片处理用于组织学观察(n=6)。使用HE与甲苯胺蓝染色观察PFJ退变情况，采用Mankin、OARSI评分系统评估PFJ软骨及软组织退变情况。
结果：
1髌骨位置与结构
1.1影像学结果显示：PLS、PLS+OVX与PLS+OVX+RAL组大鼠大鼠克氏针保持完整，无脱落，并且髌骨位置降低。PLS与PLS+OVX组Insall-Salvati(IS)比值分别显著低于Sham组与OVX组(P＜0.001)。PLS组髌骨横截面积显著高于Sham组(P=0.041,2700μm;P=0.007,4500μm)，PLS+OVX组髌骨横截面积显著高于PLS组(P=0.045,900μm;P=0.011,4500μm)，OVX组髌骨横截面积显著高于Sham组:(P=0.039,900μm)。PLS+OVX+RAL组髌骨横截面积显著低于PLS+OVX组(P=0.031,4500μm)。
2机械性异常疼痛结果
2.1各组大鼠在第0天时缩足反射阈值正常，且Sham组大鼠在整个研究过程中未出现显著变化。与手术前相比，所有PLS手术大鼠在第4周开始出现缩足反射阈值均显著降低(P＜0.05)，并随时间呈负相关变化。术后第4,6,8和10周，PLS组与PLS+OVX组50％PWT均显著低于Sham组(P＜0.01)，PLS+OVX组50％PWT均显著低于OVX组(P＜0.01)。术后第8周时，OVX加剧了大鼠缩足反射阈值的下降，PLS+OVX组50％PWT显著低于PLS组(P=0.033)。从术后第4周开始，与PLS+OVX组相比，PLS+OVX+RAL组50％PWT呈增加趋势，但是二组无统计学差异(P＞0.05)。
3PFJ退变结果
3.1软组织HE染色结果显示：PLS手术大鼠滑膜与髌下脂肪垫明显损伤，主要表现滑膜下组织广泛增殖，炎性细胞浸润，纤维增生明显；髌下脂肪垫中滑膜下组织出现广泛的血管化，大量的脂肪细胞坏死、丢失，并且被增生的纤维组织分离。Sham组与OVX组滑膜与髌下脂肪垫正常，未见炎性细胞浸润、纤维化与组织坏死。PLS组滑膜OARSI评分与髌下脂肪垫组织学评分均显著高于Sham组(滑膜与脂肪垫：P=0.01)，PLS+OVX组均显著高于OVX组(滑膜：P=0.034;脂肪垫：P=0.025)。
3.2软骨大体观察结果显示：Sham组与OVX组大鼠关节软骨表面光滑透明，无色泽改变，未见软骨侵蚀。PLS组、PLS+OVX组与PLS+OVX+RAL组滑车与髌骨软骨均表面粗糙，色泽暗淡，可见大面积软骨侵蚀，关节面边缘有骨赘形成。但是在PLS+OVX组软骨损伤最为严重，可见软骨侵蚀延伸到软骨下骨区域，伴有大面积软骨下骨暴露。PLS组软骨退变大体评分显著高于Sham组(P=0.038)，PLS+OVX组软骨退变大体评分均显著高于PLS组与PLS+OVX+RAL组(P=0.015)。
3.3软骨甲苯胺蓝染色结果显示：PLS组与PLS+OVX组大鼠关节软骨软骨细胞数量显著减少，只剩部分深层软骨细胞；表层软骨肿胀并出现水平裂隙伴软骨剥脱。软骨退变在PLS+OVX组最为显著，大面积软骨缺损，被大量增生的软组织填充，并有血管侵入。PLS+OVX+RAL组大鼠表现为表层软骨细胞数量轻度下降，细胞克隆，呈簇集样改变；软骨基质染色轻度降低，轻微肿胀并伴局部软骨缺损，软骨退变得到显著缓解。OVX组大鼠关节软骨仅出现轻度的基质染色下降与表层软骨细胞轻度增多。Sham组大鼠关节软骨大致正常。Mankin组织学评分显示：PLS组大鼠显著高于Sham组(P＜0.001)；PLS+OVX组显著高于PLS组(P＜0.001)；PLS+OVX+RAL组显著低于PLS+OVX组(P＜0.001)。
3.4Micro-CT检测结果(滑车与髌骨)显示：OVX组，PLS组与PLS+OVX组大鼠软骨下骨均出现骨量减少，骨小梁数量、厚度降低，骨小梁间距增加，板状骨小梁减少，而棒状骨小梁增加。OVX加剧了PLS诱导的骨量丢失与结构的恶化，以PLS+OVX组最为明显。PLS+OVX+RAL组大鼠治疗后软骨下骨骨量增加，结构得到显著改善。PLS组大鼠软骨下骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著低于Sham组(P＜0.01)，而Tb.Sp与SMI均显著高于Sham组(P＜0.01)；PLS+OVX组大鼠软骨下骨BMD、BV/TV、Tb.N显著低于PLS组(P＜0.05)，而Tb.Sp与SMI均显著高于PLS组(P＜0.05)；PLS+OVX+RAL组大鼠软骨下骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著高于PLS+OVX组(P＜0.05)，而Tb.Sp与SMI均显著低于PLS+OVX组(P＜0.001)。
第三部分雷洛昔芬延缓卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变作用机制的研究
目的：本研究基于RAL可以延缓卵巢切除大鼠髌股关节退变，但其作用机制尚未阐述，拟应用卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变模型，早期经灌胃给予RAL干预，进一步探讨RAL对卵巢切除并低位髌骨大鼠髌股关节退变的作用机制。
方法：将30只三月龄雌性SD大鼠随机分为5组(n=6)：Sham组、OVX组、PLS组、PLS+OVX组与PLS+OVX+RAL组。对大鼠分别行双侧卵巢切除(OVX组)、髌韧带短缩手术(PLS组)、髌韧带短缩+双侧卵巢切除(PLS+OVX与PLS+OVX+RAL组)与假手术(Sham组)。髌韧带短缩手术后72小时PLS+OVX+RAL组大鼠经灌胃给予RAL干预，剂量10mg/kg/day，其余各组大鼠经灌胃给予等体积生理盐水，大鼠于术前与手术后每周测量体重并相应调整药物剂量。RAL干预10周后进行X-ray扫描观察低位髌骨情况并进行影像学评分。经腹主动脉取血(5-8ml)处死所有大鼠，4℃离心取上层血清2ml置于-80℃环境保存，用于测定骨代谢标记物。同时获取右侧PFJ标本，置于10%福尔马林溶液中固定保存，用于软骨组织学检测与免疫组织化学检测PFJ软骨中II型胶原(collagen type II, Col-II)，基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-3, MMP-13)，聚集蛋白聚糖(aggrecan, AGG),血小板型金属蛋白酶4(metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4)与Caspase-3。甲苯胺蓝染色观察PFJ软骨退变并采用Mankin评分系统进行组织学评分。抗酒石酸磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色检测软骨下骨中破骨细胞数量，采用染色酶联免疫吸附测定试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测血清中骨钙塑(Osteocalcin,OCN)与一型胶原C端肽(C-telopeptide of type I collagen,CTX-I)的水平。
结果：
1.影像学结果
1.1影像学结果显示：PLS、PLS+OVX与PLS+OVX+RAL组大鼠大鼠克氏针保持完整，无脱落。PLS组IS比值(1.97±0.20)显著低于Sham组(2.41±0.25)(P＜0.01)，PLS+OVX组IS比值(1.96±0.15)显著低于OVX组(2.34±0.31)(P＜0.05)。
2.关节软骨退变结果
2.1软骨甲苯胺蓝染色结果显示，PLS组、PLS+OVX组大鼠滑车负重区软骨中基质染色严重减少，表面出现裂隙延伸至软骨下骨大面积软骨剥脱伴纤维组织增生、填充，潮线不齐伴有血管交叉侵入；非负重区主要表现为基质染色轻度降低，软骨细胞克隆，呈簇集样改变。髌骨整个区域表现为表层软骨细胞数量显著减少，只剩部分深层软骨细胞；软骨基质染色严重减少，肿胀并出现水平裂隙伴软骨剥脱，软骨退变在PLS+OVX组最为显著。PLS+OVX+RAL组大鼠滑车负重区软骨基质染色轻度下降，裂隙未达软骨下骨，轻度软骨缺损，潮线整齐；非负重区软骨基质染色正常，软骨细胞数量轻度增多。髌骨整个区域表现为表层软骨细胞数量轻度下降，细胞克隆，呈簇集样改变；软骨基质染色轻度降低，轻微肿胀并，局部软骨剥脱，软骨退变得到显著改善。OVX组大鼠关节软骨仅出现轻度的基质染色下降与表层软骨细胞轻度增多。Mankin组织学评分显示：两侧负重区(内侧、外侧)：PLS组大鼠显著高于Sham组(滑车：P=0.039,P=0.002;髌骨：P=0.002,P=0.033)；PLS+OVX组显著高于PLS组(滑车：P=0.009,P=0.041;髌骨：P=0.026,P=0.041)；PLS+OVX+RAL组显著低于PLS+OVX组(髌骨：P=0.026,P=0.015)。非负重区：PLS组大鼠显著高于Sham组(滑车：P=0.009;髌骨：P=0.002)；PLS+OVX组显著高于PLS组(滑车：P=0.009;髌骨：P=0.004)；PLS+OVX+RAL组显著低于PLS+OVX组(滑车：P=0.041;髌骨：P=0.004)。
2.2滑车与髌骨软骨(负重区、非负重区)免疫组织化学染色结果显示：Sham组Col-II表达水平显著高于OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05负重区)、PLS组(滑车：P＜0.05,负重区;髌骨：P＜0.05)与PLS+OVX组(滑车：P＜0.01,负重区;髌骨：P＜0.01)。PLS+OVX+RAL组Col-II表达水平显著高于PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05负重区)。
Sham组MMP-13表达水平显著低于OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05非负重区)、PLS组(滑车：P＜0.01;髌骨：P＜0.05外侧负重区除外)与PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.01)。PLS+OVX组MMP-13表达均显著高于OVX组(滑车：P＜0.001外侧负重区除外；髌骨：P＜0.05)与PLS组(滑车：P＜0.05外侧负重区；髌骨：P＜0.05非负重区除外)。PLS+OVX+RAL组MMP-13表达水平显著低于PLS+OVX组(滑车：P＜0.01内侧负重区除外、髌骨：P＜0.01)。
Sham组AGG表达水平显著高于OVX组(滑车：P＜0.05内侧负重区)、PLS组(滑车：P＜0.05;髌骨：P＜0.05外侧负重区除外)与PLS+OVX组(滑车：P＜0.05;髌骨：P＜0.01外侧负重区除外)。PLS+OVX+RAL组AGG表达水平显著高于PLS+OVX组(滑车：P＜0.05，负重区；髌骨：P＜0.05非负重区)。
Sham组ADAMTS-4表达水平显著低于PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05)。PLS+OVX组ADAMTS-4表达水平均显著高于OVX组(滑车：P＜0.01外侧负重区除外；髌骨：P＜0.05)与PLS组(滑车：P＜0.01外侧负重区除外；髌骨：P＜0.01内侧负重区与非负重区除外)。PLS+OVX+RAL组ADAMTS-4表达水平显著低于PLS+OVX组(P＜0.001外侧负重区除外；髌骨：P＜0.05非负重区除外)。
Sham组Caspase-3表达水平显著低于PLS组(滑车：P＜0.05外侧负重区除外；髌骨：P＜0.05)与PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.01)。PLS+OVX组Caspase-3表达水平均显著高于OVX组(滑车、髌骨：P＜0.01)与PLS组(滑车、髌骨：P＜0.05)。PLS+OVX+RAL组Caspase-3表达水平显著低于PLS+OVX组(滑车、髌骨：P＜0.05)。
3.软骨下骨代谢结果
3.1TRAP染色结果显示：OVX组,PLS组与PLS+OVX组大鼠软骨下骨中破骨细胞数量显著高于Sham组(P＜0.05)。PLS+OVX组软骨下骨中破骨细胞数量显著高于PLS组(P＜0.05)。RAL干预后，PLS+OVX+RAL组软骨下骨中破骨细胞数量显著低于PLS+OVX组(P＜0.05)。
3.2血清骨转换标记物水平结果显示：OVX组,PLS组与PLS+OVX组大鼠血清中OCN与CTX-I水平均显著高于Sham组(P＜0.05)。PLS+OVX组血清中OCN与CTX-I水平均显著高于PLS组(P＜0.05)。RAL干预后，PLS+OVX+RAL组血清中OCN与CTX-I水平均显著低于PLS+OVX组(P＜0.05)。
结论：
1.髌韧带短缩可导致SD大鼠髌股关节出现低位髌骨，进而导致大鼠在术后10周内PFJ软骨出现退行性改变，软骨下骨微结构恶化以及周围软组织明显损伤，该模型对阐述PFJ早期OA病理改变以及为后续药物干预提供了良好的模型基础。
2.雌激素缺乏可加重PFJ关节软骨以及软骨下骨退变，降低大鼠疼痛敏感阈值，提示雌激素缺乏是PFJOA的风险因素；同时，早期给予RAL干预可有效延缓PFJ软骨退变，增加软骨下骨骨密度以及维持微结构的稳定性，提示RAL是一种潜在的PFJOA修饰药物。
3.RAL对关节软骨以及软骨下骨具有双重的保护作用，可能通过改善软骨代谢以及抑制软骨下骨异常的骨转换，进而延缓PFJOA的病理进展。