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背景与目的:硫胺素响应性巨幼细胞贫血综合征（Thiamine-responsive megaloblastic anemia,TRMA）,是一种罕见的单基因常染色体隐性遗传病,由SLC19A2基因致病突变所致。遗传学研究发现SLC19A2基因是TRMA的唯一致病基因,位于人类染色体1q23.3位置,编码硫胺素转运蛋白-1（Thiamine transporter-1,THTR-1）,THTR-1的功能是将细胞外的硫胺素转运到细胞内。SLC19A2（C.1409insT）突变导致THTR-1转运硫胺素缺陷,细胞无法正常运转,出现氧化应激、凋亡等现象,最终出现糖尿病、贫血、耳聋等症状。目前,SLC19A2（C.1409insT）突变导致TRMA高血糖症状的具体机制未见报道。前期,我们课题组在广西壮族家系中发现一个新的TRMA致病突变SLC19A2（c.1409insT）,该患者出现糖尿病和贫血的临床表现,检测到其血液中内质网应激反应（Endoplasmic reticulum stress,ERS）信号分子葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein 78,GRP78）、活化转录因子4（Activating transcription factor 4,ATF4）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homoiogousprotein,CHOP）和B细胞白血病-淋巴瘤-2基因（B-cell leukemia-iymphoma-2,Bcl-2）的mRNA水平表达升高。因此,本研究设想TRMA高血糖症状的发病机制与ERS诱导的胰岛β细胞凋亡相关,通过建立稳定过表达SLC19A2（c.1409insT）突变的胰岛β细胞系模型,检测胰岛β细胞中ERS相关信号分子GRP78、蛋白激酶R样内质网激酶（Protein kinase R-like ER kinase,PERK）、真核起始因子2α（Eukaryotic initiation factor2α,eIF2α）、ATF4、CHOP的表达情况,探讨胰岛β细胞ERS PERK通路与SLC19A2（C.1409insT）突变之间的关系,为后续探讨ERS诱导的胰岛β细胞凋亡与TRMA高血糖的发病机制之间的关系提供理论基础,并为TRMA及相关疾病的防治提供新思路和潜在的干预靶点。方法:我们构建了野生型SLC19A2和SLC19A2（c.1409insT）突变的过表达质粒,通过慢病毒转染大鼠胰岛素瘤胰岛β细胞（INS.1）、小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞（Beta-Tc-6）和人胚肾细胞（HEK293T）,进而构建过表达SLC19A2及SLC19A2（c.1409insT）突变的INS.1、Beta-Tc-6和HEK293T三种稳定细胞系模型。将细胞分为空载病毒组（对照组）、野生型组（过表达SLC19A2）与突变组（过表达SLC19A2（c.1409insT）突变）。通过验证SLC19A2在INS.1细胞、Beta-Tc-6细胞和HEK293T细胞中的mRNA水平,从而验证SLC19A2和SLC19A2（C.1409insT）突变过表达成功。在稳定过表达SLC19A2和SLC19A2（C.1409insT）突变的HEK293T细胞中通过免疫荧光染色分析,确定THTR-1蛋白的定位及是否出现蛋白聚集现象。利用Western Blot及qRT-PCR方法分别检测INS.1细胞、Beta-Tc-6细胞中ERS PERK通路相关信号分子（GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP）的mRNA及蛋白表达水平,确定SLC19A2（C.1409insT）突变能引起ERS相关信号分子的异常升高,激活ERS PERK通路。结果:1.qRT-PCR结果显示,在INS.1细胞中,与对照组相比,过表达SLC19A2组（P=0.008）和过表达SLC19A2（C.1409insT）突变组（P=0.043）的Slc19a2 mRNA表达水平显著上调;在Beta-Tc-6细胞中,与对照组相比,过表达SLC19A2组（P<0.001）和过表达SLC19A2（C.1409insT）组（P<0.001）的Slc19a2 mRNA表达水平显著上调,差异有统计学意义,提示INS.1细胞和Beta-Tc-6细胞中SLC19A2、SLC19A2（C.1409insT）突变过表达成功。此外,在HEK293T细胞中,与对照组相比,过表达SLC19A2组（P=0.036）和过表达SLC19A2（C.1409insT）突变组（P=0.006）的Slc19a2基因mRNA表达水平显著上调,提示HEK293T细胞SLC19A2和SLC19A2（C.1409insT）突变过表达成功。因此,稳定过表达SLC19A2与SLC19A2（C.1409insT）突变的胰岛β细胞系和HEK393T细胞系构建成功。2.细胞免疫荧光染色分析结果显示,野生型的SLC19A2主要分布在细胞膜上,而携带c.1409insT突变的SLC19A2则大部分定位在细胞质和细胞核中,仅有少量定位在细胞膜上,在细胞质中存在蛋白聚集现象,推测c.1409insT突变可能导致THTR-1错误折叠,引发ERS。3.我们利用成功构建的稳定过表达胰岛β细胞系进行qRT-PCR和Western Blot实验。qRT-PCR结果显示,在INS.1细胞中,分别与对照组、过表达SLC19A2组相比,过表达SLC19A2（C.1409insT）突变组的Perk（P=0.008,P=0.026）、eIF2α（P=0.005,P=0.016）、Atf4（P=0.019,P=0.011）、Chop（P<0.001,P<0.001）mRNA表达水平显著升高;在Beta-Tc-6细胞中,分别与对照组、过表达SLC19A2组相比,过表达SLC19A2（C.1409insT）突变组的Grp78（P<0.001,P=0.007）、eIF2α（P<0.001,P=0.003）、Chop（P<0.001,P<0.001）mRNA表达水平升高。Western Blot结果显示,在INS.1细胞中,分别与对照组及过表达SLC19A2组相比,过表达SLC19A2（C.1409insT）突变组的PERK蛋白表达水平显著升高（P=0.001,P=0.001）;在Beta-Tc-6细胞中,分别与对照组及过表达SLC19A2组相比,过表达SLC19A2（C.1409insT）突变组的GRP78（P=0.004,P=0.010）、eIF2α（P=0.022,P=0.034）蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义。提示SLC19A2（C.1409insT）突变能上调GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP的表达水平,激活ERS PERK通路。结论:1.SLC19A2与SLC19A2（C.1409insT）突变在INS.1、Beta-Tc-6和HEK293T细胞中过表达成功,稳定过表达SLC19A2及SLC19A2（C.1409insT）突变的胰岛β细胞系和HEK293T细胞系构建成功。2.SLC19A2（C.1409insT）突变可改变THTR-1的细胞内定位,使其不能定位于细胞表面,且在细胞质中产生蛋白聚集现象,推测其可能导致THTR-1错误折叠,引发ERS。3.SLC19A2（C.1409insT）突变能上调ERS GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP的表达水平,激活ERS PERK通路,进而可能参与TRMA发病机制。