【摘 要】
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目的:1.以不同浓度的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）刺激大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）,探讨HMGB1对ASMCs细胞形态变化的影响及其表型标志蛋白α-SMA、SM22α表达情况的影响。2.研究HMGB1对ASMCs细胞增殖、迁移能力的影响,及其增殖细胞核抗原PCNA的表达情况。再此基础上进一步探讨HMGB1对ASMCs细胞表型的转化的影响。方法:1.酶解法提取原代大鼠气道平滑肌细胞,观察HM
【基金项目】
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项目名称:HMGB1/miR-19a在气道平滑肌（ASM）表型转换中作用及机制的研究,项目合同编号:81600020,国家自然科学基金,项目起止时间:2017年1月-2019年12月；
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目的:1.以不同浓度的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）刺激大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）,探讨HMGB1对ASMCs细胞形态变化的影响及其表型标志蛋白α-SMA、SM22α表达情况的影响。2.研究HMGB1对ASMCs细胞增殖、迁移能力的影响,及其增殖细胞核抗原PCNA的表达情况。再此基础上进一步探讨HMGB1对ASMCs细胞表型的转化的影响。方法:1.酶解法提取原代大鼠气道平滑肌细胞,观察HMGB1对ASMCs细胞形态变化的影响及α-SMA、SM22α表达情况的影响:严格无菌操作下,分离大鼠气管组织,以0.1%胶原酶I的无血清培养基酶解消化,经培养及2～3次传代后,取生长旺盛,形态良好的ASMCs进行实验。2.在六孔板中使ASMCs铺板爬片,使用间接免疫荧光法以α-actin抗体对ASMCs进行特异性鉴定,以正置荧光相差显微镜分析系统观察特异性情况。3.在六孔板中使ASMCs铺板爬片,以不同浓度的HMGB1及阳性对照物PDGF对ASMCs进行刺激,使用直接免疫荧光法以鬼笔环肽染色观察细胞形态变化。4.在六孔板中使ASMCs铺板,以不同浓度的HMGB1对ASMCS进行刺激,刺激完成后以细胞裂解液裂解细胞,提取蛋白并进行定量,以蛋白质印迹法检测α-SMA、SM22α蛋白的表达。5.在九十六孔板中使ASMCs铺板,以不同浓度的HMGB1对ASMCs进行刺激,以CCK8法测定ASMCs增值。6.在六孔板中使ASMCs铺板,用200ml移液器及枪头在孔中垂直向下在孔板底面划痕,以含有不同浓度HMGB1的1%血清的双抗DMEM对ASMCs进行刺激,刺激完成后观察划痕情况。7.在六孔板中使ASMCs铺板,以不同浓度的HMGB1对ASMCs进行刺激,刺激完成后以细胞裂解液裂解细胞,提取蛋白并进行定量,以蛋白质印迹法检测PCNA蛋白的表达。结果:1.随着HMGB1刺激浓度的增大,大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）发生了长度缩短,外形收缩变圆钝的形态改变,其细胞收缩程度随HMGB1刺激浓度增加而增大,其中HMGB1 500ng/ml组与空白对照组收缩成度相近,HMGB1 5000ng/ml组与PDGF 50n/mlg组收缩成度相近,HMGB110000ng/ml组与PDGF 100ng/ml组收缩成度相近。2.α-SMA、SM22α蛋白表达随HMGB1刺激浓度的增大而降低,α-SMA 10000ng/ml组（0.203±0.040）与空白对照组（0.865±0.096）有显著差异（P＜0.05）;SM22α10000ng/ml组（0.235±0.129）与空白对照组（0.990±0.197）有显著差异（P＜0.05）。3.随着HMGB1刺激浓度的增大,大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）的细胞吸光度在刺激后24h、48h增加。4.随着HMGB1刺激浓度的增大,大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）细胞融合程度在刺激后12h增大,至24h时空白对照组与各刺激组均已融合。5.PCNA蛋白表达随HMGB1刺激浓度的增大而增高,PCNA 500ng/ml、10000ng/ml组与空白对照组有显著差异（P＜0.05）。结论:HMGB1可以在体外使大鼠ASMCs形态收缩,收缩蛋白标志物α-SMA、SM22α表达显著降低;HMGB1可以在体外促进大鼠ASMCs增殖、迁移;上述结果提示HMGB1可能促使气大鼠ASMCs表型由收缩型向合成/增殖型转化。
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