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异戊烯基化的芳香天然产物主要是由植物、细菌和真菌产生的,它们具有重要的生物、药物活性。异戊烯基转移酶可将异戊二烯基团从其活化体(通常为二磷酸酯)转移剑芳香底物上,在异戊烯基化的芳香天然产物的生物合成中起到十分重要的作用。近年米,异戊烯基转移酶的分子生物学和生物化学研究取得了巨大的进展。不同来源的异戊烯基转移酶之间具有很低的序列相似性,并表现出不同的生化特性,包括可溶性和对金属离子的依赖性。已知的异戊烯基转移酶通常只接受异戊烯基基团供体,如二甲丙烯二磷酸(DMAPP)和香叶草二磷酸(GPP),它们对芳香底物具有很宽泛的底物特异性。因而用基因工程酶生产此类生物活性物质具有可行性,但将重组获得的异戊烯基转移酶真正用于工业生产还有相当长的路要走,还需深入研究其种类及其在异戊烯基化芳香衍生物代谢中的作用,因而本论文通过对真菌来源的某些异戊烯基转移酶基因进行了克隆表达,对在原核系统表达的重组酶的作用及其性质进行了研究。
本文的研究结果如下:
1、实验发现环形二肽异戊烯基转移酶CdpNPT和FtmPT能接受侧链或者吲哚环稍有变化的一系列色氨酸衍生物,并将它们转化成异戊烯基化的产物。酶反应产物的结构由核磁和质谱检测确定,与环形二肽CdpNPT将其N1位反式异戊烯基化、FtmPT1将其C2位顺式异戊烯基化不同,对色氨酸及其简单衍生物,这两个酶的作用结果是一样的,都只能将其N1位反式异戊烯基化。这些结果都反映了这两个酶具有底物的混交性。
2、将米曲霉DSM1147中的异戊烯基转移酶基因cTrpPT扩增出来后,克隆到pQE70并在大肠杆菌中过量表达。表达得到的带六个组氨酸标签的CTrpPT蛋白经纯化后,与L-色氨酸或含色氨酸的环形二肽在二甲基丙烯基二磷酸存在的体系中反应。高效液相监测产物的生成,结果显示cTrpPT在某些方面与已知的吲哚类异戊烯基转移酶具有显著差异。该酶对芳香底物具有高度特异性,但却不像其他吲哚类异戊稀基转移酶对异戊烯基化位置表现出强烈选择性。本研究还发现cyclo-L-Trp-L-Trp较其他检测的环形二肽被该酶接受的难度要低很多,与其他异戊烯基转移酶只有一个主产物不同,该酶的反应混合物中最少能检测到两个产物峰。氢谱和碳谱检测,包括多键碳氢关系(HMBC)、核欧佛豪瑟效应频谱(NOESY),证明在以cyclo-L-Trp-L-Trp为底物的反应体系中的酶产物分别为C7-位和N1-位异戊烯基化的产物,它们之间的比例在1:1.2左右。经测定,该酶对二甲基丙烯基二磷酸的酶动力学常数为2.5 mM,对cyclo-L-Trp-L-Trp的为0.3 mM,转换数为每秒0.33。
3、在Leptosphaeria maculans的sirodesmin PL生物合成途径中,SirD主要负责将酪氨酸的O-位异戊烯基化。本文主要研究了SirD对苯丙氨酸,酪氨酸及色氨酸衍生物的作用。在19种检测的苯丙氨酸/酪氨酸衍生物中,有12种能发现有新产物的生成。结果显示,底物苯环上的丙氨酸基团及对位上的电子供体如羟基或氨基对其是否能被该酶接受具有决定性的影响,但侧链及苯环稍作变动后仍能作为的底物参与反应。随后将该酶与7种苯丙氨酸/酪氨酸底物反应的酶产物分离并经质谱和核磁分析,发现都为苯环的C4位上的O-或N-位被异戊烯基化的产物。经测定,它们的酶动力学常数在0.10到0.68 mM之间。催化效率在430到1110 S-1·M-1之间,其中酪氨酸为最适底物。此外,14种检测的色氨酸衍生物中有7种能被SirD接受,与7-DMATS的酶产物比较后,确定这些酶产物也为C7-位异戊烯基化的衍生物。