研究背景脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是一种常见的发生于中枢神经系统（Central nervous system,CNS）的严重创伤性疾病,致死致残率高,发病率逐年上升,给患者、家庭及社会带来了沉重的负担。近现代以来,各种治疗方法如药物治疗、功能康复治疗、高压氧治疗、手术干预治疗、红光、微波等各种辅助治疗被应用于治疗SCI及其相关并发症,取得了一定的效果,但均不能彻底治愈。因此,寻找更为有效的治疗SCI的靶点和方法仍是脊柱外科领域的研究重点和难点。动物实验表明抑制某种补体成分,可减轻SCI后炎症反应和神经元损伤,促进神经再生和功能恢复。敲除小鼠C3基因可以减轻SCI后继发性损伤,提高神经再生能力,抑制早期炎症反应。使用C5a拮抗剂能显著提高SCI后小鼠运动恢复能力,改善损伤后脊髓组织。目前急性SCI治疗指南中糖皮质激素（甲强龙等）是临床重症SCI患者常规用药。但作为免疫抑制剂,糖皮质激素的副作用及不良反应也限制了其在临床中的应用。因此研发新的免疫调节剂改善SCI后免疫微环境的变化具有重要的临床意义。近年来临床研究发现,骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）移植在SCI动物模型中发挥神经修复作用,是SCI最有前途的治疗策略。但干细胞移植的致畸、免疫排斥、肺栓塞、移植率低、存活率低等问题,限制其临床应用。目前研究发现:移植的BMSCs在宿主体内释放多种生物活性物质,如细胞外囊泡、神经营养因子及免疫调节物质等,这些生物活性物质可通过旁分泌效应与宿主细胞进行交流,改变细胞的行为学从而发挥神经保护和修复作用。外泌体（exosome,Exo）是细胞外囊泡的一种,其内含有丰富的生物活性物质:蛋白质、脂质、mRNA、microRNA（miRNA）和长链非编码RNA等。近年来研究发现外泌体具有多种多样的功能,可以改善缺血再灌注损伤,抑制肺部炎症反应,促进血管新生,促进伤口愈合及脑神经细胞修复等作用。本课题利用大鼠SCI半切模型,探讨BMSCs来源的外泌体（exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs-Exo）对 SCI 后损伤脊髓的保护作用,探讨补体系统改变对这一过程的影响。为治疗SCI提供一种新的思路,为寻找更安全有效的、无细胞治疗SCI新方法提供理论和实践依据。第一部分骨髓间充质干细胞来源的外泌体的提取鉴定及体外胞吞实验目的:分离提取鉴定BMSCs来源的外泌体,并通过外泌体示踪技术确定其能被细胞吸收,为SCI的治疗提供新的治疗策略。方法:原代分离培养大鼠BMSCs,收集其条件培养基并通过Millipore超滤管超滤联合外泌体提取试剂盒qEV分离柱提取BMSCs-Exo,使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy,TEM）观察 BMSCs-Exo 形态,使用纳米颗粒跟踪分析仪观察BMSCs-Exo大小分布。提取BMSCs-Exo总蛋白,使用免疫蛋白印迹法明确BMSCs-Exo的标志性蛋白分子;PKH26标记BMSCs-Exo并于BV-2细胞共孵育12h,免疫荧光检测BMSCs-Exo分布情况。结果:BMSCs-Exo在TEM观察下可呈现圆形或类圆形单囊泡或多囊泡存在,纳米颗粒跟踪分析结果显示粒径大小为81.2±4.2 nm,蛋白质印迹法证实其表达TSG101、CD9特征表面分子,免疫荧光结果显示PKH26标记BMSCs-Exo能被BV-2细胞胞吞。结论:1.超滤法联合排阻色谱法可从BMSCs的细胞基上清液中提取BMSCs来源的外泌体,并且可提高外泌体的富集程度。2.从BMSCs细胞基上清液中提取的外泌体从大小、形态、特征蛋白等方面符合相关方面的国际标准。3.BMSCs-Exo在体外可被小胶质细胞摄取。第二部分骨髓间充质干细胞来源的外泌体对大鼠SCI后功能恢复作用的研究目的:建立大鼠SCI模型,研究BMSCs-Exo对大鼠脊髓损伤恢复及大鼠功能行为的影响。方法:1.构建大鼠SCI实验模型为了研究SCI,我们采用脊髓半切法构建SCI模型,使用雄性Wistar大鼠,体重200-250g。麻醉成功后,去除T9、T10棘突及椎板,暴露白色脊髓及脊髓背侧中央血管,眼科虹膜刀彻底切断右半侧脊髓,完成模型构建。2.动物分组、给药实验动物随机分为3组假手术组（Sham组）,脊髓损伤组（SCI组）,外泌体治疗组（SCI+Exo组）。通过尾静脉注射给药,SCI+Exo组每只给药500μL BMSCs-Exo,Sham组和SCI组给予同体积的磷酸缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）。3.BMSCs-Exo对大鼠运动功能的影响采用运动功能评分（Basso,Beattie and Bresnahan scores,BBB）及斜板实验分别于1、3、7、14、21和28天观察并记录监测运动功能情况,评估BMSCs-Exo对大鼠运动功能的影响。4.BMSCs-Exo改善大鼠SCI的组织学检测分别于造模后3天及28天灌注取材固定,制备脊髓组织石蜡切片,进行常规苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）及神经元特异性核蛋白（neuronal specific nuclear protein,NeuN）免疫组化染色,评估脊髓组织情况。5.BMSCs-Exo荧光染色示踪大鼠尾静脉注射PKH67标记的BMSCs-Exo,检测BMSCs-Exo体内分布及是否被脊髓组织接受。结果:1.BMSCs-Exo能减轻脊髓损伤,改善大鼠运动功能恢复情况。采用BBB评分评估大鼠造模后运动功能恢复情况,实验前所有大鼠BBB评分均为21分,SCI造模后的大鼠均表现为后肢瘫痪,在观察期间SCI组和SCI+Exo组BBB评分均逐渐升高。进入第7天后,观察到SCI+Exo组运动功能评分明显优于SCI组（第7天,p＜0.05;第14天,p＜0.01;第21天,p＜0.05;第28 天,p＜0.05）。采用斜板实验评估大鼠造模后肌力恢复情况,实验前所有大鼠斜板实验角度均为70°,SCI造模后的大鼠均表现为后肢瘫痪,在观察期间SCI组和SCI+Exo组大鼠斜板实验均逐渐升高,进入第7天后,观察到SCI+Exo组运动功能评分明显优于SCI组（第7天,p＜0.05;第14天,p＜0.05;第21天,p＜0.05;第28 天,p＜0.05）。2.BMSCs-Exo能减轻SCI后脊髓组织病理损伤HE染色、免疫组织化学染色发现Sham组细胞形态正常,排列有序,细胞核清楚,灰白质界限清晰;SCI组细胞可见较多及较大的损伤空洞,结构明显疏松,部分细胞出现明显空泡,细胞核深染,损伤区域的细胞形态较差,散在较多的细胞碎片。经BMSCs-Exo治疗后SCI+Exo组细胞组织形态结构较损伤组改善,空泡减少,炎性细胞减少。3.BMSCs-Exo能进入大鼠损伤脊髓组织PKH67荧光标记的BMSCs-Exo示踪实验显示,BMSCs-Exo荧光信号能进入脊髓组织,在肝、脾、肾脏中也有分布。荧光显微镜观察到大鼠SCI后1天损伤部位即出现荧光信号,3天后荧光强度显著增强,7天后明显减弱。在肝、肾、脾脏组织中的分布显示第1天荧光强度最强,第3天荧光强度减弱,第7天荧光强度最弱。结论:1.BMSCs-Exo可以减轻脊髓损伤,提高大鼠运动功能恢复。2.BMSCs-Exo可以减轻SCI后脊髓组织病理损伤。3.尾静脉注射BMSCs-Exo第1天即可到达损伤部位,3天后BMSCs-Exo量达到最大。第三部分骨髓间充质干细胞来源的外泌体在大鼠SCI后蛋白组学分析及抑制补体活化机制的研究目的:采用蛋白组学技术筛选SCI后脊髓组织损伤微环境中的差异蛋白,对差异蛋白进行功能注释及富集,并对富集后补体蛋白进行分析研究,初步探讨BMSCs-Exo在SCI治疗中的蛋白分子水平上的调控机制,为进一步优化BMSCs-Exo治疗SCI提供理论依据。方法:实验动物随机分为3组假手术组（Sham组）,脊髓损伤组（SCI组）,外泌体治疗组（SCI+Exo组）。通过尾静脉注射给药,SCI+Exo组每只给药500μL BMSCs-Exo,Sham组和SCI组给予同体积的PBS。在造模成功72小时后,收集各组损伤脊髓组织行串联质量标签（Tandem Mass Tags,TMT）定量蛋白质组学寻找差异蛋白并基因本体论（GeneOntology,GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析。对寻找到的补体蛋白进一步分析并通过反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）对蛋白组学数据进行验证。进行C1q免疫组化染色及核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）蛋白质免疫印迹法检测。PKH67示踪BMSCs-Exo联合小胶质细胞的免疫荧光检测,检测BMSCs-Exo是否被脊髓组织小胶质细胞接收。结果:应用蛋白组学在Sham组、SCI组、SCI+Exo组共同鉴定到的蛋白7215个。在共同鉴定到的蛋白中,SCI组和Sham组比较,差异显著的蛋白总数839个。这些差异显著的蛋白中显著上调的蛋白总数584个,显著下调的蛋白总数255个;在共同鉴定到的蛋白中,SCI+Exo组和SCI组比较,差异显著的蛋白总数121个,其中显著上调的蛋白总数10个,显著下调的蛋白总数111。对这些差异蛋白进一步KEGG通路注释和富集分析发现补体系统蛋白差异较大,其中SCI组和Sham组之间,24种补体蛋白显著上调;SCI+Exo组与SCI组相比,在这24种补体蛋白发现了 7个显著下调蛋白。RT-PCR进一步验证了这种变化。免疫组化分析显示,Sham脊髓组织标本中C1q阳性细胞较少,而SCI组中C1q阳性细胞较多。与SCI组相比,BMSCs-Exo处理降低了 SCI+Exo组的C1q表达。免疫荧光结果显示,SCI大鼠的脊髓组织损伤部位附近大量表达Iba-1。在小胶质细胞中发现大量标记的BMSCs-Exo,其中大部分BMSCs-Exo聚集在小胶质细胞胞浆中的小簇内。蛋白免疫印迹分析的结果显示,SCI组与Sham组比,SCI损伤能引起磷酸化NF-κB（p-p65）水平显著升高,经外泌体治疗后SCI+Exo组与SCI组相比,p-p65显著下调。结论:BMSCs-Exo可以抑制补体系统蛋白mRNA合成和释放并且可以进入损伤脊髓组织的小胶质细胞,抑制NF-κB的激活。BMSCs-Exo可能是SCI的潜在治疗手段,而补体系统可能是这种治疗相关的主要靶点。