研究背景和目的舌鳞状细胞癌(TSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,发病率占口腔鳞状细胞癌(OSCC)的43.4%,且侵袭性强,淋巴结转移率高。目前的治疗方案主要是以手术为主的综合治疗,但TSCC患者的5年生存率仍不令人满意。如何改善TSCC患者术后辅助治疗的效果,进而提高生存率一直是亟待解决的重要问题。近年来,肿瘤的免疫治疗取得突破性进展,其中PD-L1是应用最为广泛的靶点之一。在肿瘤细胞中,高表达的PD-L1能够导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡,进而使肿瘤逃脱机体的免疫监控。在OSCC中,PD-L1的表达升高与OSCC的发生和发展密切相关,并且已有相关药物应用于临床,但治疗效果仍待改善。溴结构域蛋白4(BRD4)是溴结构域及超末端结构(BET)家族中的一员,含有两个串联的溴结构域及一个超末端结构域。在整个细胞周期中,BRD4通过招募不同的转录调节因子,在调控DNA的复制、细胞周期、基因转录等细胞活动均有重要作用。近年的研究表明,BRD4在多种肿瘤的发生和发展中具有重要作用,且靶向抑制BRD4治疗恶性肿瘤的研究已取得了良好的效果。这其中JQ1因对BRD4具有高度亲和性和特异性,广泛应用于BRD4的相关研究中。在一些其他部位肿瘤的研究中,BRD4可以通过升高PD-L1来达到免疫逃逸的目的。因此我们考虑BRD4与PD-L1在TSCC的发生和发展中同样表达升高,两者之间具有密切关系。基于以上想法,我们拟通过生物信息学技术分析BRD4与PD-L1与口腔颌面部鳞癌的关联,明确研究的可行性;在TSCC临床标本和体外细胞中,进一步验证BRD4与PD-L1两者之间的调控关系,同时对两者之间的调控机制进行探索。总之,本研究将临床指标与基础研究相结合,明确BRD4与PD-L1在TSCC中的相互作用,并对两者在TSCC细胞中的调节机制进行了探究,为TSCC相关的协同免疫治疗提供新的治疗靶点,并为免疫治疗的联合用药提供新的思路。材料和方法:1.基于生物信息学分析BRD4与PD-L1在口腔颌面部鳞癌中的表达及临床意义(1)使用UALCAN与GEPIA数据库分析BRD4与PD-L1在口腔颌面部鳞癌中的表达情况,并利用GEPIA及HNCDB数据库分析两者的相关性。(2)使用UALCAN数据库分析BRD4和PD-L1的表达与临床病理因素的关系,并利用GEPIA及HNCDB数据库对患者预后进行分析。2.TSCC组织标本中BRD4与PD-L1的表达及临床病理因素分析(1)使用免疫组织化学(IHC)的方法检测BRD4与PD-L1在46例TSCC组织与41例癌旁正常组织标本切片中的表达情况;使用实时定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)实验检测15例新鲜TSCC组织及癌旁正常舌粘膜组织中BRD4与PD-L1的mRNA和蛋白表达情况。(2)对TSCC标本中BRD4和PD-L1的表达情况进行统计,计算两者之间的统计学相关性,并将表达情况与临床病理因素进行分析。3.TSCC细胞系中BRD4对PD-L1表达的调节作用研究(1)将干扰RNA(siRNA)转染入Ca127和Osc19细胞沉默BRD4基因,通过使用QRT-PCR与Western blot选择出最显著一组,并使用同样方法检测本组中PD-L1的表达情况;使用CCK8筛选出JQ1(BRD4靶向抑制剂)的最佳浓度,在此浓度下作用12、24、48h后PD-L1的mRNA和蛋白表达情况。(2)使用空白对照病毒筛选出Ca127和Osc19细胞中转染的最佳MOI值,按照此条件转染病毒升高BRD4表达,使用QRT-PCR与Western blot检测PD-L1的mRNA和蛋白表达情况。(3)使用免疫荧光和流式细胞技术,观察BRD4表达升高或降低后PD-L1在Ca127和Osc19细胞膜上的表达情况。4.BRD4在TSCC细胞中调节PD-L1的机制研究(1)使用 String database 数据库分析 BRD4、C-MYC、CDK9 及 PD-L1 之间的相互关系。(2)在Ca127和Osc19细胞中高表达或敲除BRD4后,使用QRT-PCR与Western blot检测C-MYC与CDK9的表达。(3)筛选出Ca127和Osc19细胞中干扰效果最显著的C-MYC与CDK9的siRNA,使用QRT-PCR与Western blot检测PD-L1的mRNA和蛋白表达情况。(4)通过转染慢病毒升高Ca127和Osc19细胞中C-MYC或CDK9,使用QRT-PCR与Western blot检测PD-L1的mRNA和蛋白表达情况。5.构建裸鼠移植瘤模型,分析在体内抑制BRD4后对TSCC生长的影响及相关基因的表达情况。(1)使用Ca127和Osc19细胞裸鼠皮下成瘤后,定期尾静脉注射JQ1,对荷瘤的体积和最终重量进行记录,并进行统计学分析。(2)对分离出的荷瘤组织切片后行免疫组化验查,并使用QRT-PCR与Western blot检测荷瘤组织内BRD4、PD-L1、C-MYC与CDK9的mRNA和蛋白的表达情况。实验结果1.口腔颌面部鳞癌中BRD4与PD-L1的生物信息学分析结果(1)在UALCAN对BRD4与PD-L1分别进行了分析,结果显示两者在口腔颌面部鳞癌中均表达升高,具有统计学意义。随后,通过GEPIA数据库中的相关性分析显示两者并无统计学关联。但是在HNCDB数据库中,通过整合数据库中OSCC的内容,分析显示BRD4在口腔鳞癌中与PD-L1的表达呈正相关。(2)在UALCAN数据库中,对BRD4与PD-L1的表达与临床病理因素进行了分析,结果表明:BRD4的表达在男性中显著升高,且中低分化较高分化患者表达升高,但与年龄、癌症的分期及淋巴结转移无关;PD-L1在I期患者中表达较Ⅳ期升高,在高龄患者(61-80岁)中较低龄患者(21-40岁)表达升高,在淋巴转移患者中有统计学差异(N1VSN2)并与多种淋巴细胞浸润有关,但与其他因素无统计学关联。使用GEPIA与HNCDB数据库进行分析后表明,PD-L1的表达与口腔颌面部鳞癌患者无病生存期(DFS)有关,且BRD4与PD-L1可共同影响患者的无进展生存期(PFS)。2.TSCC组织标本中BRD4与PD-L1的表达及临床病理因素分析结果(1)TSCC组织标本的IHC结果显示BRD4主要表达于细胞核,PD-L1主要表达于细胞质及细胞膜,两者在TSCC中的表达明显升高;在新鲜组织中,以正常组织作为对照,TSCC中BRD4与PD-L1的mRNA和蛋白水平显著上调。(2)对TSCC组织中PD-L1与BRD4的表达情况进行统计,结果显示PD-L1与BRD4在TSCC中的表达具有相关性;PD-L1的表达与TSCC患者的淋巴结转移及肿瘤TNM分期具有统计学关联,而与患者年龄、性别、吸烟史及肿瘤分化程度无关;BRD4在TSCC中的表达略有不同,除了与患者淋巴结转移相关以外,还与肿瘤分化程度具有相关性,但患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤TNM分期等因素与BRD4的表达无关。3.TSCC细胞中BRD4对PD-L1表达的调控作用(1)首先将siRNA转染入Ca127细胞与Osc19细胞沉默BRD4基因,通过QRT-PCR与Western blot的检测发现第一组(siBRD4#1)干扰作用最显著。同时发现,siBRD4#1作用下Ca127与Osc19细胞内PD-L1的mRNA与蛋白表达水平明显降低。通过CCK8检测BRD4的靶向药物JQ1浓度梯度对细胞增殖的影响,选取抑制细胞的最小剂量5μM/ml作用于Ca127与Osc19细胞,结果显示随时间的延长,JQ1抑制BRD4作用逐渐增强,同时PD-L1的表达从第24h开始受到明显抑制。(2)使用空白病毒转染Ca127与Osc19细胞,筛选后发现令人满意的最低剂量分别为:Ca127 细胞中 MOI=10,Polybrene=4μg/ml;Osc19 细胞中 MOI=30,Polybrene=4μg/ml。按照上述条件将转染入Ca127细胞与Osc19细胞。检测结果显示BRD4显著升高的同时,PD-L1的表达也显著升高。(3)通过免疫荧光的方法发现降低或升高BRD4时,细胞中PD-L1的表达也随之改变,再次验证了 BRD4在TSCC细胞中对PD-L1的调控作用。同时,细胞膜表面PD-L1的表达同样随BRD4的改变而发生变化。相同的结果通过流式细胞技术检测细胞膜表面的PD-L1抗体荧光强度得到证实。4.TSCC细胞中BRD4调节PD-L1的机制研究(1)String database 数据库分析结果表明 BRD4、C-MYC、CDK9 及 PD-L1 四种蛋白之间在人体中具有关联。其中,BRD4、C-MYC与CDK9三种蛋白关联较为密切,BRD4的基因分别与C-MYC、CDK9的基因在表达过程中具有密切关系。PD-L1与C-MYC在少量文献报道中有关联,与CDK9、BRD4并未发现直接的关联。(2)使用siRNA与JQ1分别抑制BRD4表达,结果显示C-MYC与CDK9在Ca127与Osc 19细胞中的mRNA与蛋白水平表达量明显降低;同时使用QRT-PCR与Western blot检测BRD4慢病毒感染后TSCC细胞中C-MYC与CDK9的表达情况,显示两者mRNA与蛋白水平的表达明显升高。(3)在siRNA中筛选出抑制C-MYC与CDK9效果最好的一组,进而分别抑制C-MYC与CDK9的表达,结果显示抑制C-MYC后PD-L1的mRNA与蛋白的表达均明显降低,而抑制CDK9后PD-L1的表达未见明显改变。将慢病毒转入的Ca127与Osc19细胞内并稳定表达C-MYC或CDK9,结果显示C-MYC升高后,PD-L1的mRNA与蛋白表达明显升高,而使用JQ1抑制BRD4时可以逆转PD-L1表达的升高;而CDK9升高后,PD-L1的表达在mRNA与蛋白水平均未见明显改变。5.构建裸鼠移植瘤模型,在体内抑制BRD4后对TSCC生长的影响及相关基因的表达情况。(1)注射TSCC细胞2周后,裸鼠注射部位皮下形成质硬的荷瘤结节,呈圆形或椭圆形,逐渐增大。测量注射JQ1后肿瘤体积,结果显示JQ1注射组裸鼠荷瘤的体积较对照组增长明显缓慢,最终重量分别为Ca127组:705.5±38.1 mg VS 545±27.lmg,P<0.05;Oscl9 组:567.8±117.8 mg VS 342.2±30.2 mg,P<0.05,均具有统计学意义。(2)对裸鼠的瘤体组织进行免疫组化检查,结果显示在TSCC瘤体组织中,JQ1注射组BRD4、CDK9、C-MYC以及PD-L1的表达均较对照组降低。随后在mRNA与蛋白水平上得到了相同的结果。结论1.生物信息学分析表明BRD4与PD-L1在口腔颌面部鳞癌中表达上调,且两者在口腔鳞癌中表达呈正相关,两者与口腔颌面部鳞癌患者的多种临床病理因素和预后相关联。2.在TSCC组织中,BRD4与PD-L1表达明显升高,且两者之间具有显著的统计学关联。其中BRD4的表达与淋巴转移和分化程度有关,PD-L1的表达与淋巴转移和TNM分期有关。3.在TSCC细胞中,BRD4可以上调PD-L1在mRNA和蛋白水平的表达,并显著升高细胞膜表面的PD-L1的表达量。4.在TSCC细胞中,BRD4可以上调C-MYC与CDK9在mRNA和蛋白水平的表达;另外,BRD4可以通过C-MYC升高PD-L1的表达。5.在裸鼠体内,BRD4下调可以显著抑制TSCC荷瘤的生长,并且抑制PD-L1、C-MYC与CDK9的表达。