诱导多能干细胞(iPSCs)技术一经问世便被寄予厚望,人们希望凭借iPS技术实现患者自体的细胞替代疗法,为重大疾病如帕金森综合征的疾病模型构建和治疗提供新的解决方案。但是,过低的诱导效率、对重编程机制认识的不足以及由此带来的克隆异质性等问题成为iPS技术临床应用面临的巨大阻碍。如何从有限的起始细胞中获得尽可能多的、满足临床应用要求的克隆成为摆在科研工作者面前的科学问题。体外培养的精原干细胞仅通过改变培养条件就可以实现细胞重编程,返回至多能性状态,这表明维持精原干细胞自我更新的转录因子很有可能亦是潜在的体细胞重编程促进因子。本研究从这一思路出发,通过文献检索筛选了目前已知的在精原干细胞自我更新和维持中起到关键作用的转录因子,将它们分别与经典的Yamanaka四因子(OSKM)进行组合,共同诱导体细胞重编程。通过与经典OSKM组合比较发现,过表达Etv5能够显著提高细胞重编程效率,而敲低Etv5则会降低体细胞重编程的效率。经由OSKM+Etv5组合获得的克隆,表达多种多能性标记物,并通过了体内体外分化能力测试。进一步探究发现,Etv5主要通过Tet2-miR200s-Zeb1调控轴作用于间质-上皮(MET)转化过程,影响体细胞重编程。鉴于Etv5在体细胞重编程中的促进作用,我们进一步探索了Etv5在多能干细胞中的作用。敲低Etv5通过Tet2下调了基因组整体的5hmC水平,但却不影响小鼠胚胎干细胞(mESCs)多能性状态的维持。在mESCs的EB分化试验中,敲低Etv5导致了原始内胚层(primitive endoderm)标记物的下调与原始外胚层(primitive ectoderm or epiblast)及其衍生物标记物的上调,证明Etv5具有正向调控原始内胚层分化而负向调控原始外胚层分化的能力。具体研究内容和结果如下:1.Etv5促进细胞重编程通过文献检索确定在精原干细胞自我更新中具有重要作用的转录因子,将它们分别同Yamanaka四因子组合,共同诱导细胞重编程,发现Etv5能够显著提升细胞重编程效率,敲低内源Etv5则会显著降低细胞重编程效率。通过在重编程不同时间点引入Etv5过表达,发现Etv5主要作用于细胞重编程的早期。由OSKME诱导获得的iPSCs(OSKME-iPSCs)呈典型的mESCs克隆形态,在多能性的标记物的表达上同经典OSKM-iPSCs没有显著差异,并且完成了核心多能性因子Oct4和Nanog启动子区域的去甲基化修饰。此外,通过体外EB分化实验和体内畸胎瘤实验证明,OSKME-iPSCs具备向三胚层组织细胞分化的潜能,特别是在向生殖细胞的定向诱导试验中,OSKME-iPSCs表现出更好的响应外界诱导信号的能力。2.Etv5通过Tet2-miR200-Zeb1调控轴促进MET通过测定诱导初期成纤维细胞的增殖速度,比较细胞周期调控因子的表达,排除了Etv5通过促进细胞快速增殖促进重编程的可能性。对重编程早期细胞上皮细胞标志物CDH1的检测结果表明,OSKME诱导下的小鼠成纤维细胞的MET过程发生时间更早,程度更高。qRT-PCR检测证明,Etv5主要通过Tet2-miR200s-Zeb1调控轴对MET过程发挥作用。双荧光素酶报告实验未能证明Etv5对Tet2的直接作用关系,暗示Etv5很有可能是通过间接方式调控Tet2的表达。3.Etv5调控小鼠胚胎干细胞向原始外胚层和原始内胚层的分化在mESCs中,Etv5对Tet2的调控关系依然成立,敲低Etv5降低了mESCs的增殖速度,下调了mESCs基因组5hmC水平,但不影响mESCs多能性标记物的表达。高通量测序发现,受Etv5敲低影响的基因主要集中于血管生成、MAPK信号通路、细胞运动和视觉器官发生等生物学过程。将Etv5-KD转录组数据与Tet2-KD转录组数据进行联合分析,确立了Etv5和Tet2对Gata6的共同调控关系,并在mESCs类胚体(EB)实验中发现,Etv5能够正向调控mESCs向原始内胚层的分化,负向调控mESCs向原始外胚层及其衍生物的分化。综上所述,本研究揭示了精原干细胞来源转录因子Etv5对体细胞重编程的促进作用及其作用机制,对Etv5在mESCs多能性调控中扮演的角色做了初步探究,增进了人们对Etv5的认识,为提高细胞重编程效率,解构重编程机制提供了新思路。