目的：糖尿病是严重威胁人类健康的常见病和多发病，胰岛移植不仅可以使糖尿病患者减少或脱离外源性胰岛素的使用，更重要的是这种治疗方法可以阻止糖尿病并发症的发生和发展。但由于免疫排斥反应和供体缺乏限制了胰岛移植的应用。干细胞极强的自我更新能力和多向分化潜能为糖尿病细胞治疗开辟了新的途径。本实验采用妊娠3.5d昆明小鼠囊胚分离培养ESC，并采用无血清、无饲养层、多种生长因子分阶段诱导的方法将其定向诱导分化为胰岛素前体细胞，为干细胞治疗糖尿病奠定实验基础。 方法：1、选取妊娠3.5d昆明雌性小鼠，冲胚后挑取扩展充分、ICM明显的囊胚培养至裸胚孵出并呈柱状生长时，采用胰酶-EDTA消化辅助机械法分离培养ESC，进行AKP和Oct-4免疫荧光染色鉴定。取妊娠13.5d昆明雌性小鼠制备MEF饲养层。2、用不含hLIF的ESC培养液制备液滴，选取生长旺盛、形态典型的ESC集落，采用胰酶-EDTA消化辅助机械法处理后悬浮培养4d，形成EBs，行Nestin免疫荧光染色。3、将ESC定向诱导分化为胰岛素前体细胞，首先需要L-多聚赖氨酸和纤维粘连蛋白包被培养皿，然后ITSFn筛选Nestin阳性细胞6d， bFGF扩增及初步诱导6d，再以烟碱诱导功能成熟的胰岛素前体细胞27d。应用DTZ染色、Insulin免疫荧光染色对定向诱导的细胞进行鉴定。 结果：1、ESC的分离培养：将扩展充分的囊胚放置在饲养层上4d后，可见囊胚ICM自透明带中孵出，呈柱状生长，中央颜色深于周边，并将周边的饲养层细胞推开。ESC呈典型的克隆样生长，细胞界限清晰，相差显微镜下折光性强。2、ESC的AKP染色和OCT-4免疫荧光染色：两种染色均呈阳性表达。3、EBs的形成及向Nestin阳性细胞的诱导：ESC悬浮培养4d可形成EBs，经ITSFn筛选6d后可见9096 Nestin阳性细胞。4、Nestin阳性细胞向胰岛素前体细胞的分化：烟碱诱导6d后，上皮样细胞增多，细胞逐渐密集形成类胰岛样组织；诱导15d，DTZ染色可见集落的边缘细胞被染成腥红色；诱导27d，Insulin免疫荧光染色可见染色阳性细胞团簇。 结论：自妊娠3.5d昆明小鼠囊胚分离培养ESC；采用无血清、无饲养层、多种生长因子分阶段诱导的方法将ESC定向诱导分化为胰岛素前体细胞。