镉是环境污染物中常见的有毒重金属，肾脏是镉慢性中毒的主要靶器官，长期暴露可导致不可逆的肾功能损伤。近些年来，镉诱导肾细胞凋亡已成为各国学者对镉分子机理的一个研究热点，而且镉引起的氧化应激已被认为是其诱导细胞凋亡的重要机制。大量研究表明，镉引起的氧化损伤与细胞内的活性氧水平增加，SOD下降，MDA上升及耗竭细胞内的谷胱甘肽有关，并发现采用抗氧化剂可对镉引起的氧化损伤具有一定的保护作用，但对于其作用机制尚未完全明确。JNK通路是生物体内存在的与氧化应激密切相关的一条凋亡途径，属于丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinases，MAPKs）信号途径的超家族，对细胞增值，存活及死亡具有重要的调节作用，因而研究该通路能否在镉诱导细胞凋亡过程中被激活具有重要的理论意义。另外，本实验室前期研究发现，抗氧化营养素维生素C、维生素E和硒对镉抑制猪肾小管上皮细胞（LLC-PK₁）生长均具有一定的保护作用，其中，硒的作用效果最好。抗氧化微量元素—硒是人体必需的矿物质，许多报道提示其具有拮抗镉毒性的作用，但其对镉的毒性保护机制仍不十分清楚。基于上述研究，本课题从营养角度出发，拟探讨抗氧化微量元素—硒对镉抑制猪肾小管上皮细胞（LLC-PK₁）生长及诱导凋亡的影响，并进一步研究硒对镉激活JNK通路的调控的作用，并对相关的凋亡蛋白caspase-3，p53，bcl-2进行检测，为深入阐明硒对镉诱导凋亡的保护作用的分子机制提供重要的理论依据，为镉中毒的防治提供新的线索和思路。第一部分硒对镉抑制LLC-PK₁细胞生长及其诱导细胞凋亡的影响目的：探讨硒对镉引起肾细胞生长抑制及诱导凋亡的影响。方法：本研究采用体外培养LLC-PK₁的方法，通过噻唑蓝（MTT）比色法观察硒对镉抑制LLC-PK₁细胞增值的影响；荧光显微镜观察硒对镉诱导细胞凋亡的形态学影响；流式细胞技术测定硒对镉诱导细胞凋亡率的变化情况。结果：10～30μM的硒对镉抑制LLC-PK₁细胞的生长具有一定的保护作用，并呈现一定的剂量效应关系；荧光染色法显示，当加入20μM硒作用30 min后，再加入40μM镉继续作用12 h后，发现凋亡形态学变化比单独染镉组减弱；另外，当细胞用20μM硒预先处理30 min再暴露40μM镉12 h，凋亡率为16.5％，与单独染镉组相比凋亡率明显降低（87.6％）。结论：硒对镉引起的抑制肾细胞生长及其诱导细胞凋亡均具有一定的保护作用，其机理有待进一步深入研究。第二部分硒保护镉诱导LLC-PK₁细胞凋亡的机制研究目的：研究硒对镉引起氧化应激JNK通路激活的作用及凋亡相关蛋白caspase-3，p53，bcl-2表达的影响。方法：通过免疫印记法检测JNK通路中蛋白（磷酸化JNK和总JNK）及相关凋亡蛋白的表达变化，采用酶标法检测caspase-3酶活性的变化。结果：单独染镉组的LLC-PK₁细胞，JNK的磷酸化表达水平随着染毒时间的延长其表达呈增强趋势，在9 h达峰值，12 h后逐渐下降；同时发现随着染镉浓度的增高，JNK的磷酸化蛋白表达水平不断增强，总JNK蛋白的表达水平均无明显变化；当预先加入20μM硒作用30 min后再染镉（40μM，9h），结果发现与单独染镉组相比，JNK磷酸化表达水平有所下调，这与预先加入NAC（活性氧的阻滞剂）的效应相同；染镉（40μM）作用0-12 h后，发现细胞内caspase-3的活性呈时间依赖性上升趋势。当预先加入硒或NAC作用30 min后再染镉，caspase-3活性下降；镉处理LLC-PK₁细胞后，bcl-2蛋白的表达量逐渐减少，p53蛋白的表达量逐渐增加，并呈明显的时间依赖性。当预先加入20μM硒作用30 min后再染镉（40μM，9h），发现硒可以部分抑制镉引起的p53蛋白上调，而对镉引起的bcl-2蛋白下调的作用不明显。结论：硒对镉引起LLC-PK₁细胞凋亡具有一定的保护作用，其机制可能与抑制镉引起JNK通路的活化进而诱导caspase-3的激活，及抑制促凋亡蛋白表达等方面有关。