根据2020年全球癌症统计数据,肺癌在恶性肿瘤中发病率居第二,但死亡率居第一。肺癌也是我国最常见且死亡率最高的恶性肿瘤,通常只有16%的患者能于早期诊断,大多数患者诊断即为晚期或已转移。癌症的发生是一系列基因突变累积的结果,二代测序技术的应用已经在癌细胞中发现数百万个体细胞突变,但只有少数的频繁突变的基因（在所有与肿瘤相关的突变中）对癌症的启动和进展有重要意义（称“司机”突变）。事实上,大部分基因突变对癌细胞的生物学机制并没有明显影响（称“乘客”或“旁观者”突变）。基因组编辑提供了通过实验操作将基因型与表型联系起来的可能性。功能基因组筛选技术可有效地从众多突变中识别出“司机”突变。目前,已经发现了许多潜在的癌基因及抑癌基因并对其功能进行了注释,但是,由于肿瘤的异质性,许多影响癌症发生发展的功能基因并未被发现。在许多情况下,抑癌基因（TSGs）是通过转录抑制（通常称为表观遗传沉默）而不是突变事件失活的,因此无法通过传统的基因组测序方法进行识别。CRISPR-Cas9敲除文库高通量阳性筛选技术是对已成功整合敲除文库的细胞施加一定的筛选压力,仅使少数目的表型的细胞能够存活,达到富集关键基因的目的。通过将已整合CRISPRCas9敲除文库的正常细胞移植到裸鼠皮下,使少数获得致瘤性的细胞能够存活,从而富集到正常细胞致瘤性转化过程关键的TSGs。因此,筛选新的TSGs对研究癌症早期发生及其机制至关重要,可为癌症早期诊断提供新思路。另外,由于非小细胞肺癌（NSCLC）的高度异质性及极易发生耐药性,目前对于NSCLC患者的治疗效果有限,5年生存率仍然很低。鉴于恢复失活的TSGs功能非常困难,事实上很难将TSGs作为药物治疗的靶点。因此,新的潜在药物治疗靶点的发现将有助于对NSCLC临床治疗提供新的策略,而细胞生存必需基因可能是理想的治疗靶点。在本研究中,首先构建稳定表达Cas9蛋白的人肺正常上皮BEAS-2B细胞系,在该细胞中感染含有77441个单链向导RNA（sg RNA）、靶向19114个人类基因的Brunello慢病毒文库,于裸鼠皮下移植。提取瘤体细胞（Tumor）及移植前细胞（Input）的全基因组DNA,扩增sg RNA序列,建库进行测序。通过分析Tumor中sg RNA读数占比及Tumor与Input中sg RNA读数差异倍数改变,筛选功能缺失后诱导BEAS-2B细胞致瘤性转化的TSGs,并利用公共数据平台进行初步验证。接着利用Bio GRID Open Repository of CRISPR Screens（ORCS）数据库对已有的数据库进行深度筛选与分析,以选出候选生存必需基因,并进一步利用CRISPR慢病毒获得稳定敲除候选生存必需基因的人肺腺癌A549细胞系,并检测其对A549细胞增殖及克隆形成能力的影响。主要结果与结论如下:1.人正常肺上皮细胞致瘤性转化中抑癌基因的全基因组筛选首先构建了稳定表达Cas9蛋白的BEAS-2B细胞,并成功进行了文库感染及裸鼠皮下成瘤实验,结果显示只有感染文库的细胞在部分接种位点成瘤。进一步测序显示,Tumor中只检测到少数sg RNA,本文选取sg RNA的读数占总读数的比例＞1%或有两个及以上sg RNA被显著富集的38个基因为有效的人肺癌候选TSGs,其中包括NF2、PTEN等5个已知TSGs,及33个未在肺癌中报导或作用机制并未明确的新的候选TSGs如AP2M1、PSENEN等。表明筛库设计合理,实验结果有效,并成功筛选出了38个有效的人肺癌（候选）TSGs,可进行后续分析。2.在临床样本数据库中对前述人肺癌（候选）抑癌基因功能的初步验证富集分析发现前述38个有效的人肺癌（候选）TSGs均在Notch和Hippo信号等参与癌症发生的关键生物学通路中富集。应用临床NSCLC样本数据库进一步证实,结果表明前述38个有效的人肺癌（候选）TSGs在临床NSCLC样本中均发生了突变,其中PDCD10和AP2M1的突变率大于15%;突变率大于2%的17个基因中有14个与已知高突变基因KRAS或TP53发生共突变,有3个基因的突变与预后相关;30个基因在临床NSCLC样本中的表达水平与正常癌旁组织有明显差异,17个基因的表达水平与患者的预后密切相关。表明人肺癌（候选）抑癌基因与临床NSCLC的发生和发展具有较好的相关性。3.候选的细胞生存必需基因的选取及功能验证细胞生存必需基因是癌细胞治疗的理想靶点。研究表明,NF-κB信号的激活促进了癌症的发生和发展,因此,NF-κB信号通路正向调控因子可为潜在的癌细胞治疗靶点。首先利用ORCS数据库,选取了33个不同癌细胞系（其中包括4个NSCLC细胞系）的细胞生存必需基因且为NF-κB信号通路正向调控因子的LIN37,以及人胚胎干细胞系HUES62的蛋白激酶N3（PKN3）基因作为候选的细胞生存必需基因。接下来,利用体外细胞培养实验,慢病毒感染肺腺癌A549细胞系并分别靶向敲除LIN37或PKN3后,发现A549细胞的增殖能力均明显下降;在1%甲基纤维素克隆形成实验中,与对照细胞相比,候选的细胞生存必需基因敲除的A549细胞的克隆形成能力均明显减弱,克隆形成数量和克隆体积均明显减小。综上所述,本研究首先利用体内全基因组CRISPR/Cas9技术,筛选出了38个有效的人肺癌（候选）TSGs,并在临床NSCLC样本数据库中对其功能进行了初步验证,为正常细胞致瘤性转化机制的研究提供了新线索。接下来,利用ORCS数据库对已有的细胞生存必需基因数据库进行了深度筛选与分析,筛选出了候选的细胞生存必需基因LIN37及PKN3,并实验验证了其分别敲除之后均可抑制肺腺癌A549细胞的增殖及克隆形成,为临床NSCLC治疗提供了新靶点。