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本文主要从以下三个部分展开论述： 第一章 Nur77基因敲除导致小鼠卵巢发育异常和不孕 卵泡发育的进程和卵巢功能的发挥依赖于卵巢内各种细胞之间的相互作用，并且受多种调节因子和性腺激素的共同调控。孤儿核受体Nur77作为一种功能广泛的转录调控因子，已被许多文献证实参与了卵巢中类固醇激素的合成以及排卵的过程。为了深入了解其在卵巢中的具体作用及相关机制，本实验首先繁育了Nur77基因全身性敲除(knockout，KO，/-)的雌性小鼠并进行了基因型的鉴定。通过对Nur77-/-小鼠和野生型（wild type，WT，+/+）小鼠卵巢组织学切片进行HE染色以及免疫组化检测cleaved caspase-3表达，我们发现Nur77-/-小鼠在9周龄时与Nur77+/+相比，卵泡数量较多，颗粒细胞凋亡较不明显。而25周龄的Nur77-/-卵巢中凋亡的颗粒细胞和闭锁卵泡明显增多，40周龄时Nur77-/-卵巢中已基本无明显的生长卵泡。连续繁殖法观察Nur77-/-和Nur77+/+小鼠生育情况可以发现，Nur77-/-小鼠自25周龄后较Nur77+/+小鼠的产仔数量逐渐减少，至32周龄后出现不孕。不同周龄的Nur77-/-小鼠和Nur77+/+小鼠在动情前期时血清中FSH水平并无明显差异。此外，我们利用real-time PCR调查发现不同周龄时Nur77-/-小鼠卵巢中Amh、Nobox、AR、Kitl和Inhα的表达水平异常，提示Nur77-/-小鼠卵巢发生的病理改变与这些因子参与的调控机制有关。因此本研究认为，Nur77是调控卵泡生长发育的重要因子，小鼠Nur77基因敲除会造成卵泡闭锁加快，提前出现卵泡耗竭和不孕。 第二章 Nur77的线粒体转位诱导卵巢颗粒细胞凋亡 在T细胞以及多种肿瘤细胞中，许多凋亡刺激物的诱导都能引起Nur77表达的快速增加，使Nur77从细胞核转位至线粒体，导致线粒体中cytochrome c的释放，最终促进细胞凋亡。卵泡中颗粒细胞的凋亡是卵泡闭锁的重要原因，对于维持哺乳动物卵巢内环境的稳定具有重要的意义。因此本实验主要着眼于Nur77在博莱霉素刺激的人卵巢颗粒细胞癌细胞系KGN和小鼠卵巢原代颗粒细胞(mGC)中，对细胞凋亡过程的影响。以博莱霉素终浓度20μM刺激mGCs和KGN后，real-time PCR检测发现，Nur77的mRNA水平在2h内上升至高峰，随后发生下降，直至24 h时又有轻微上升。腺病毒Ad-GFP-Nur77感染KGN后，再给予博莱霉素刺激，可导致Nur77由细胞核转位至线粒体。腺病毒Ad-Nur77以0、10、20和40 MOI感染mGC后，给予博莱霉素20μM刺激，利用Cell DeathDetection ELISA法检测细胞凋亡，结果显示细胞凋亡程度呈梯度上升。而分离培养Nur77+/+和Nur77-/ mGCs并给予博莱霉素刺激后，Nur77-/-细胞凋亡程度的上升趋势较弱。腺病毒介导KGN细胞中Nur77高表达，再给予博莱霉素刺激后，凋亡细胞增多（流式细胞仪检测），并且细胞总蛋白中cleaved caspase-3的水平较LacZ组升高，胞质中cytochrome c的蛋白水平也明显高于对照组。此外，在高表达Nur77的mGCs中加入雄激素通路抑制剂flutamide，再给予博莱霉素刺激，结果显示Nur77对细胞凋亡的促进作用可被flutamide所抑制。最后我们以博莱霉素0.15 mg腹腔注射3周龄的Nur77+/+和Nur77-/-雌鼠后，卵巢切片进行cleaved caspase-3免疫组化染色，结果发现Nur77-/-卵巢内凋亡颗粒细胞和闭锁卵泡的数量较少。因此我们的实验结果显示，Nur77的线粒体转位可介导卵巢颗粒细胞凋亡，从而可能对卵泡的正常闭锁和卵巢内稳态的维持发挥重要作用。 第三章 Nur77调控卵巢雄激素受体基因的表达 雄激素受体(androgen receptor，AR)是核受体家族的成员之一，在卵巢中表达于各类生长中卵泡，参与了卵泡生长和发育的过程。既往研究表明，孤儿核受体Nur77对类固醇激素信号通路和卵泡成熟起到了重要作用。因此我们假设卵巢中，Nur77可能参与调控AR的表达水平，影响雄激素经由AR的信号通路。我们首先建立了Nur77基因敲除(knockout，KO，-/-)的小鼠模型，利用real-timePCR检测发现20周龄的Nur77-/-小鼠(n=5)卵巢中，AR和雄激素信号通路靶基因Kitl的mRNA水平较野生型(wild type，WT，+/+)(n=5)分别下降35％和24％，提示Nur77可能在体内转录调控AR水平。随后在mGC以及KGN细胞中，利用腺病毒介导Nur77高表达，real-time PCR和western blot检测发现AR的mRNA和蛋白水平均上升，而抑制内源性Nur77则使得AR表达水平下降。染色质免疫共沉淀及荧光素酶报告基因实验证实，Nur77可结合于小鼠和人类AR基因启动子区的NGFI-B结合元件(NBRE)，激活AR的启动子活性。而在体外培养的Nur77-/-小鼠颗粒细胞中，AR启动子活性则无法被Nur77激活。此外，Kitl作为雄激素信号通路的靶基因，可在mGCs和KGN细胞中被雄激素(AD)诱导，而被雄激素抑制剂flutamide(FL)所抑制。KGN细胞中高表达Nur77可增强AD对Kitl的诱导作用，而Nur77-/-的小鼠颗粒细胞中AD的诱导作用被削弱，FL的抑制作用则增强了。因此我们的研究结果显示，Nur77可在卵巢内上调AR表达，参与调控雄激素信号通路，从而可能在卵泡发育过程中发挥极其重要的作用。