缺血性脑卒中(Ischemic Stroke)是常见的脑血管疾病,易复发、易致死、预后差,严重影响人类生命健康和日常生活,给家庭和社会造成巨大的经济负担。脑缺血再灌后导致的神经元轴突回缩、断裂是引起神经功能障碍的主要原因。促进受损神经元轴突生长,形成稳定的突触网络,重建神经信号传递在缺血性脑卒中的病理过程中具有重要作用。因而,神经保护和神经元功能恢复的治疗一直是目前临床前研究的焦点,但至今尚未发现有效用于促进轴突生长、改善神经功能的药物。脑红蛋白(Neuroglobin,Ngb)是一个17kDa的单体球蛋白,主要在大脑神经元胞质中表达。脑红蛋白与氧有较强的亲和力,而且与氧结合后不易解离。脑红蛋白不仅与02、CO、NO等小分子结合,还与G-protein等大分子蛋白直接结合并调控其活性。大量文献表明,过表达Ngb对缺血/缺氧/氧化应激等因素造成的中枢神经系统损伤具有保护作用,提示脑红蛋白作为神经保护因子对缺血性脑卒中等中枢神经系统损伤的治疗具有潜在应用前景。本课题采用小鼠大脑中动脉栓塞/再灌模型(I/R)和原代培养神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型作为研究对象模拟患者缺血性脑卒中,分别在动物水平、细胞水平和分子水平探讨缺血后脑红蛋白对受损神经元轴突生长能力的调控作用及其机制。小鼠大脑中动脉栓塞模型中,Ngb的表达随着缺血再灌注不同时间点逐渐升高,而且在受损神经元生长锥明显聚集,提示Ngb表达与缺血损伤后的轴突再生长正相关。氧糖剥夺模型中,敲降内源性Ngb明显抑制原代培养皮层神经元轴突再生长,而过表达Ngb则促进神经轴突再生长。为了进一步探讨Ngb促进受损神经元轴突再生长的分子机制,在氧糖剥夺模型中,原代培养的皮层神经元中过表达Ngb同时予不同信号通路特异抑制剂处理,发现仅p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580能够明显抑制Ngb促进轴突生长的作用。氧糖剥夺/复氧处理后,通过免疫荧光双标实验、免疫印迹实验、双分子荧光互补实验和GST pull down实验证明Ngb与p38通过直接结合,促进p38磷酸化/激活。Ngb功能位点突变结果证明,Ngb-p38的直接结合作用在OGD/R处理神经元后主要依赖于Ngb的氧结合位点H64;过表达NgbH64L促进p38磷酸化。GSTpull down实验进一步证明,p38主要结合Ngb的7-122位氨基酸区域。此外,GST pull down实验还证明Ngb-p38直接结合作用与Ngb两个磷酸化位点(即T77和S145)明显相关。过表达Ngb-T77和NgbS145显著促进p38磷酸化。最后,通过导入外源性穿膜蛋白TAT-Ngb证明Ngb能够明显促进缺血损伤后神经元生长相关蛋白GAP43的表达及神经元轴突的再生长。在脑卒中、脊髓损伤等中枢神经系统损伤的研究模型中,促进缺血损伤后神经元轴突生长已被证明可以明显改善神经功能。因此,明确缺血应激后脑红蛋白对受损神经元的促轴突生长作用及调控机制将对促进脑功能恢复、治疗缺血性脑卒中等疾病有潜在应用前景。