犬腹泻病毒的感染在犬腹泻疾病中极为常见,幼犬治疗周期长和治愈力低的特征可能对宠物主人造成极大的精神伤害。犬细小病毒（Canine Parvovirus,CPV）、犬冠状病毒（Canine Coronavirus,CCoV）、犬星状病毒（Canine Astrovirus,CaAstV）和犬库布病毒（Canine Kobuviruses,CaKoV）作为腹泻病毒的主要成员,其临床症状相似导致临床鉴别诊断极为困难,因此制备能对这四种腹泻病毒病的病原体进行快速鉴别诊断的实验室检测方法具有重大意义。而其中CPV更是构成尤为严重的威胁。CPV能在犬中广泛传播并引起犬发病或死亡,是一种急性接触性传染病,该病发病率和病死率高且传播速度快。同时犬作为最受欢迎的伴侣动物之一,与人类生活也紧密相关。因此对该病毒进行全面的流行病学调查以及相关基础研究,有助于为有效的防控治疗提供帮助。与单一实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法相比,多重real-time PCR能够在一个反应中同时检测多种病原体,具有更便捷的特性。在本实验中首次设计了能同时检测 CPV、CCoV、CaAstV 和 CaKoV 的 TaqMan 多重 real-time PCR 检测方法。优化体系发现四重real-time PCR检测方法中最适的引物和探针浓度分别为0.2μM和0.05 μM,最适退火温度为56℃。对4种靶标病毒混合模板的检测灵敏度为102 copies/μL。该方法与犬细环病毒（Torque teno canine virus,TTCaV）,犬流感病毒（Canine influenza virus,H3N2 CIV）,犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）病原均无交叉反应,并且具有特异性强、灵敏性高以及重复性好等优点,能有效应用于临床检测和实验室大规模的流行情况分析中。以此检测方法为基础,本研究从上海,浙江,江苏,安徽,广东,黑龙江等多个省份采集了 1004份犬肛拭子和粪便,其中包括611份和393份非腹泻和腹泻病料。采用多重real-time PCR方法检测病料中潜在的CPV以及与CCoV、CaAstV、CaKoV的共感染情况。检测结果显示CPV共计阳性228份,在非腹泻和腹泻病料中阳性率分别为46/611（7.5%）,182/393（46.3%）,并且统计了 CPV与其他腹泻病毒的共感染情况,接近35%的CPV 阳性犬只与其他病毒存在共感染。本流行病学调查提供了CPV在犬只中的高感染率的证据。随后,扩增了其中强阳性病料的VP2基因序列全长,最终获得127条序列,氨基酸位点分析发现了 CPV-2亚型中之前并未见报道过的非同义突变,其中包括异亮氨酸I219V缬氨酸,谷氨酰胺Q386K赖氨酸两个位点。本研究结果表明该病毒在持续变异,这使得持续的流行病学监测和实时疫苗开发变得尤为重要。此外,通过结合之前研究报道的氨基酸位点分型,发现我国5个省份黑龙江,安徽,上海,浙江,广东省目前的流行亚型均为CPV-2c,然而进一步深入统计发现我国流行亚型的改变也与时间的推移有很大的关系。系统发育分析表明,CPV-2c分离株与其他亚洲和非洲毒株相似,可能具有国际传播性和持续发展性。总体而言,我们的研究提供了有关CPV在中国当前流行情况的详细信息,这表明CPV的持续发展可能对诊断和未来控制策略提出新的挑战。此外,鉴于CPV的广泛流行,本研究纯化了本实验室已有的CPV-2a毒株VP2原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,制备杂交瘤细胞,以间接酶联免疫吸附实验（indirect enzyme linked immunosorbent assay,间接 ELISA）方法进行杂交瘤细胞株的筛选,阳性克隆孔亚克隆3次。最终获得了四株能稳定分泌针对VP2蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F5、3C2、3D7、4E7。单抗亚型分析结果显示,四株单抗亚型均为IgG1κ。四株单克隆抗体均能与本实验的CPV-2a亚型毒株在免疫印迹（Western-Blot,WB）和间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescentassay,IFA）上拥有良好的反应性,与H3N2 CIV和猫杯状病毒无反应。此外,利用纯化截短体蛋白并进行WB试验后,初步确定了四株单抗识别的B细胞表位范围在71-107个氨基酸之间。本研究在CPV感染的诊断以及其VP2蛋白的基因结构,功能和抗原性研究中具有潜在的应用价值。