论文部分内容阅读
第一部分神经肽P物质对ST2细胞增殖分化的影响目的:初步探讨神经肽P物质(Neuropeptide substance,SP)对ST2细胞成骨分化过程中增殖和分化的影响,并筛选出合适的促增殖分化的SP作用浓度和时间。方法:将第三代(P3)ST2以5×103/孔铺板于96孔板,用含有不同浓度SP(10-10Mol/L、10-8Mol/L、10-6Mol/L、10-5Mol/L)的成骨条件培养基(Osteoblast Medium,OBM)进行刺激,以仅含2%胎牛血清(FBS)的OBM作为对照组(control),每组设5个复孔和1个调零孔。分别以SP刺激ST2细胞24、48、72h,CCK-8检测细胞增殖活性,筛选出合适的药物浓度。然后取第三代(P3)的ST2按8×104/孔密度铺板于6孔板,加入含有10-6Mol/L浓度SP 的 OBM,培养 1,3,5,7 天,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(CollaⅠ)和骨钙素(osteocalcinv,OCN)的表达,实验重复3次。并采用免疫荧光染色检测细胞ALP的活性。结果:(1)神经肽 P 物质(Neuropeptide substance,SP)可促进小鼠 BMSCs(ST2细胞)的增殖活性,且与SP的浓度和作用时间有一定的相关关系,当SP浓度为10-6Mol/L时,细胞增殖效应最明显。(2)神经肽 P 物质(Neuropeptide substance,SP)可促进小鼠 BMSCs(ST2细胞)的成骨分化,早期成骨分化标记物ALP的表达在第5天时达峰值,中晚期标志物Colla Ⅰ、OCN的表达在第7天时最高。SP可增强ST2细胞ALP的活性。结论:祌经肽 P 物质(Neuropeptide substance,SP)可促进小鼠 BMSCs(ST2 细胞)的增殖和成骨分化,该效应具有剂量依赖性和时间依赖性。第二部分BMP信号通路对SP促ST2细胞成骨分化过程的调控作用研究目的:探讨BMP信号通路在SP促ST2细胞成骨分化过程的作用。方法:取P3的ST2以8×104/孔的密度铺板于6孔板,设3个复孔。实验分组为SP 组:10-6Mol/L SP;SP+BMP 通路抑制剂(Noggin)组:10-6Mol/L SP 和 100ng/ml Noggin;抑制剂组:100ng/mlNoggin;对照组:等体积2%FBS,培养5天或7天后采用ELISA法检测细胞上清液中ALP,ColIa Ⅰ和OCN的表达量,并采用免疫荧光染色检测细胞的ALP活性。结果:(1)SP可明显促进ST2细胞成骨分化标记物ALP、ColIa Ⅰ和OCN的表达,加入BMP信号通路抑制剂Noggin后,标记物的表达显著减少,且仅加入Noggin也可抑制ALP、ColIa Ⅰ和OCN的表达。(2)免疫荧光染色结果显示SP可促进ST2细胞ALP的表达活性,加入BMP信号通路抑制剂Noggin后,ALP活性受到抑制,单纯加入Noggin也可抑制细胞ALP的活性表达。结论:SP可促进ST2的成骨分化和ALP活性表达,而BMP信号通路抑制剂Noggin可抑制其效应的发挥,表明BMP信号通路可能在SP促ST2细胞成骨分化中产生了一定的调节作用。