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开花过程(即成花)在相当的程度上决定着繁育是否成功,是高等植物最关键的生命时期之一,近年来已成为植物生殖发育研究的新热点,并且该领域的研究对农业和园艺生产有着重要意义。其中,LEY基因是目前研究得比较深入的成花相关基因之一。LFY基因作为花分生组织特性基因,被认为是很多植物由营养生长向生殖生长转变的主要调控因子之一。
真核生物基因的选择性剪接极大地丰富了基因表达产物的多样性和基因表达的复杂程度。选择性剪接改变蛋白质结构域、活性、定位,及影响蛋白质亚基或蛋白质间的互作、转录后调控,甚至产生无功能的产物。其在调控植物生长、发育、遗传、免疫及抗性等方面的作用已越来越为研究者们所关注。而成花过程则恰恰是选择性剪接等调控机制的有机组合和协调作用,因此,成花过程中涉及的选择性剪接成为一个重要的研究部分。
本研究进行了成花调控基因LFY的表达分析,及其可能的选择性剪接研究,并通过基因转移,对较少报道的LFY基因选择性剪接产物(1275bp片段)进行一定的功能验证。意在研究LFY基因发生的可变剪接事件及其对LFY基因功能的影响。研究结果如下:
1.用RT-PCR法克隆了LFY基因的两个转录本cDNA,即1263bp片段和1275bp片段。序列分析结果表明,1263bp片段包含了完整的编码序列。1275bp片段除包含除完整的编码序列外,在第一外显子和第二外显子间还保留了第一内含子3’末端12bp序列。
2.用RT-PCR法克隆了LFY基因发生可变剪接部位的三个片段:LFY1239,LFY1263和LFY1275,分别代表了存在的三种可变剪接转录本。在营养生长期拟南芥莲座叶中包含了三种,而在开花期的花器官和莲座叶中只包含两种(LFY1263,LFY1275)。序列比对结果显示,转录本LFY1239缺失了第一外显子靠近3’端的36bp片段可能导致LFY蛋白质在N末端缺失GTHHALDALSQE这12个氨基酸残基而丧失活性,成为一个无功能的表达产物;转录本LFY1263包含从起始密码到终止密码的全部开放阅读框序列;转录本LFY1275在第一外显子和第二外显子间保留了第一内含子的3’端12bp片段。
3.通过高浓度(3.5%)的琼脂糖凝胶电泳分离,并利用BioSpectrum ImagingSystem自带的VisionWorks LS软件对电泳照片进行光密度分析。结果显示LFY基因三种不同转录本在拟南芥不同生长发育阶段其相对含量有所差异。表现为,LFY1263在三个分子中所占比例最大,结合已报道的证据,该转录本对开花诱导有着重要意义。LFY1239只在营养生长期的莲座叶被检测到,并且编码序列存在一定缺失,这是否提示其对拟南芥成花诱导作用不大? LFY1275和LFY1263在营养生长期和开花期均存在,两转录本在不同时期莲座叶中的相对比例较稳定,在花器官中LFY1275相对于LFY1263的比例却有所增加。但是,转录本LFY1275和LFY1263在拟南芥的生长发育和开花诱导过程中,是独立作用还是协同作用,还需要深入的研究。
4.用LFY1275 cDNA构建了植物组成型表达载体pBL1275,转入根癌农杆菌GV3101菌株,并浸染多头切花菊“绿宝石”品种无菌苗茎段材料,初步获得了17株Kan抗性苗,其中PCR检测阳性为9株,占抗性苗的52.94%。利用RT-PCR检测了移栽2个月后的9株PCR阳性苗,其中7株为RT-PCR阳性,表明LFY1275能够在转化植株中表达。
5.与未转化植株相比,移栽的转基因植株长势较弱。部分植株出现分枝的主茎、侧芽的提早分化生长,一定程度上揭示了LFY1275可能与侧芽的提早分化有关;部分植株出现异形叶;还有部分发生不明原因的萎蔫。
本研究对拟南芥LFY基因存在的3个选择性剪接转录本的差异表达及转录本LFY1275的功能研究结果表明,在拟南芥生长发育相关信号传递及成花诱导的过程中,LFY基因的选择性剪接存在发育时期特异性,并且可能通过丰富其表达产物而扩大了与其它基因的相互协调作用而使调控更加广泛、灵敏和有效。