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研究背景和目的:口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma,OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤,约占口腔恶性肿瘤的90%,具有较强的局部侵袭性,早期易转移至颈部淋巴结,晚期发生远处器官转移,最常见的转移器官是肺。肿瘤组织内除肿瘤细胞以外还有其他间质细胞,其中癌相关成纤维细胞（Carcinoma-associated fibroblasts,CAFs）是OSCC组织中最主要的间质细胞。细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）是由细胞分泌的直径30-150 nm的脂质双分子膜包裹的小囊泡,在细胞间通讯中起重要作用,它可以携带重要的信号分子,广泛地存在于多种体液中。根据2018年国际细胞外囊泡协会提出的EVs命名标准,将粒径小于200 nm的EVs称之为小细胞外囊泡（small EVs,sEVs）。本课题组针对OSCC源性CAFs分泌的sEVs进行了一定的研究,结果显示CAF sEVs携带血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial cell growth factor,VEGF）,体外体内均可以促进血管新生。本研究目的是探究OSCC源性CAFs分泌的sEVs是否增加血管通透性以及如何抑制CAFs sEVs增加血管通透性。材料与方法:本研究所用的细胞包括以下五株:从两例新鲜OSCC组织中提取两株CAFs原代细胞,分别命名为CAF-S1和CAF-S2;利用Ⅰ型联合Ⅳ型胶原酶消化方法从新生儿脐带中提取原代人脐静脉内皮细胞（primary Human umbilical vein endothelial cells,p HUVECs）;OSCC细胞系选用UM-SCC6。我们利用细胞免疫荧光染色方法对提取的CAFs进行鉴定,证明我们提取到了OSCC来源的CAFs。收集细胞的条件培养液（Condition Medium,CM）,经过差速联合超高速离心的方法得到sEVs,利用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）、蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）以及纳米粒子示踪技术（Nanoparticle tracking analysis,NTA）方法对sEVs的形态、表面标志物以及粒径大小进行鉴定。我们选用5-6周龄的雌性BALB/c小鼠进行体内实验,探究CAF sEVs对血管通透性的影响,实验设置为四组,分别为PBS对照组、r VEGF165处理组、UM-SCC6 sEVs处理组和CAF sEVs处理组。我们在微流控芯片微通道内接种p HUVECs,模拟血管内皮屏障,探究CAF sEVs对血管内皮屏障的作用。以r VEGF165为阳性对照,不同浓度的r VEGF165或r VEGF165与贝伐单抗共同处理p HUVECs 24小时,同时不同浓度的CAF sEVs、CAF sEVs与贝伐单抗共同处理或CAF sEVs经过Heparinase III消化后与贝伐单抗共同处理p HUVECs 24小时,之后进行免疫荧光染色,分别检测p HUVECs中血管内皮细胞钙黏蛋白（Vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin）及闭锁连接蛋白1（Zona occludens1,ZO-1）的表达,在倒置荧光显微镜下观察并拍照,随后进行统计学分析。结果:1.OSCC源性CAFs及其分泌的sEVs的鉴定（1）细胞免疫荧光染色结果显示CAFs的Pan-CK表达阴性,Vimentin和FSP-1表达阳性,提示其为间质细胞,而非上皮细胞。FAP和α-SMA表达阳性,提示我们所提取到的CAFs显示活化的成纤维细胞性质。（2）我们采用差速联合超高速离心法从CAFs、UM-SCC6的CM中提取到sEVs,WB结果显示这些sEVs均表达典型的EVs阳性生物学标志物,包括CD63、CD9和HSP70,不表达内质网标志物CALNEXIN;TEM观察显示sEVs呈典型的双凹圆盘状;NTA检测显示sEVs粒径分布多在50-100 nm之间,以上结果表明本研究提取的sEVs符合国际细胞外囊泡研究学会对EVs的鉴定标准。2.OSCC源性CAFs分泌的sEVs增加小鼠肺血管通透性小鼠体内血管通透性实验结果显示,r VEGF165、UM-SCC6 sEVs和CAF sEVs组小鼠的肺组织中均可见渗漏到间质中的TRITC-Dextran,而PBS组小鼠少见有TRITC-Dextran渗漏到肺间质中。量化分析结果显示CAF sEVs组小鼠渗透出肺血管的右旋糖酐荧光面积更多显著高于PBS、r VEGF165和UM-SCC6 sEVs组。该结果提示CAF sEVs可以增加小鼠肺组织中血管通透性,在此方面的性能显著高于OSCC肿瘤细胞分泌的sEVs。因此,我们后续对CAFs分泌的sEVs进行了深入研究。3.基于微流控芯片的血管内皮屏障模型的建立为体外研究CAF sEVs对血管内皮屏障的影响,我们基于微流控芯片构建了血管内皮屏障体外模型。该微流控芯片由两条微通道构成,两条通道分别有进样口和出样口。我们将p HUVECs加入通道内,96小时后细胞间连接紧密,细胞活性鉴定结果显示细胞活性率大于95%,少见死亡细胞。4.OSCC源性CAFs分泌的sEVs在体外降低VE-cadherin和ZO-1的表达我们在微流控血管内皮屏障模型上考察了CAF sEVs对p HUVECs内皮屏障的影响,以r VEGF165为阳性对照,结果显示随着r VEGF165浓度的增加,VEcadherin和ZO-1的表达水平均呈下降趋势,部分区域内皮细胞之间出现裂隙。进而,我们采用CAF-S1/S2 sEVs刺激内皮屏障,结果显示随着CAF-S1/S2 sEVs浓度的增加,VE-cadherin和ZO-1两种蛋白的表达水平也均呈下降趋势,这些结果提示CAF-S1/S2 sEVs可能通过下调VE-cadherin和ZO-1的表达增加血管通透性。5.Heparinase III恢复CAF sEVs对贝伐单抗的敏感性我们继续在微流控血管内皮屏障模型上考察贝伐单抗能否抑制CAF sEVs发挥作用,发现贝伐单抗可以有效抑制r VEGF165增加血管通透性。但是CAF-sEVs与贝伐单抗共同作用时,p HUVECs中VE-cadherin及ZO-1的表达水平相比CAF sEVs单独作用组无明显差别,而当CAF sEVs经过Heparinase III消化处理,再联合贝伐单抗刺激p HUVECs,VE-cadherin以及ZO-1表达水平增加,说明Heparinase III可以释放CAF sEVs中的VEGF,恢复其对贝伐单抗的敏感性。结论:（1）CAFs sEVs在小鼠体内可显著增加肺血管通透性。（2）CAF sEVs可能通过下调p HUVECs的VE-cadherin和ZO-1的表达,破坏血管内皮屏障,增加血管通透性。（3）CAF sEVs对贝伐单抗耐受,当肝素酶释放CAF sEVs中的VEGF后,可恢复其对贝伐单抗的敏感性。