动物精子发生是雄性个体产生成熟精子的生物学过程,精子发生异常直接影响雄性个体的育性。因此,精子发生的调控机制一直是动物生殖发育生物学领域的研究热点和难点之一。Sox30是Sox基因家族成员。小鼠中的研究显示,Sox30在精子形变过程中发挥作用。然而,迄今为止在其他脊椎动物如鱼类中还未见有关Sox30功能的研究报道。我们前期的转录组分析显示,Sox30在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)精巢中高表达。本研究中,我们通过Western blot和免疫荧光技术分析了Sox30在不同发育阶段尼罗罗非鱼性腺中的表达模式和细胞定位,运用CRISPR/Cas9技术分析了Sox30突变对尼罗罗非鱼精巢发育和精子发生的影响,利用Ch IP-seq和蛋白组学分析了Sox30在尼罗罗非鱼精子发生中的作用机制,并探究了尼罗罗非鱼精巢高表达的Dmrt1转录因子对Sox30转录的调控作用。本研究得到的主要结果如下:1.Sox30在不同发育阶段尼罗罗非鱼性腺中的表达变化及细胞定位利用抗尼罗罗非鱼Sox30的抗体,通过Western blot检测了Sox30在孵化后30天(30 days after hatching,30 dah)、75 dah、90 dah和180 dah尼罗罗非鱼性腺中的表达变化,发现Sox30在75 dah的精巢中有表达,在90 dah和180 dah精巢中的表达升高;但是,Sox30在卵巢中不表达。我们进一步应用免疫荧光技术检测了Sox30在5 dah、30 dah、90 dah和180 dah尼罗罗非鱼性腺中的表达定位情况,结果显示Sox30在90 dah和180 dah雄鱼精巢的精母细胞、圆形精子细胞和输出精管的上皮细胞及180 dah雄鱼精巢的精子中表达,在成熟精子中也有表达。2.Sox30在尼罗罗非鱼精巢发育和精子发生中的功能我们应用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了尼罗罗非鱼Sox30的纯合突变系。在此基础上,我们对90 dah和180 dah的Sox30纯合突变及野生型雄鱼的精巢进行了形态解剖学和组织学分析。苏木精-伊红染色结果显示,90 dah野生型与Sox30纯合突变雄鱼的精巢都有精原细胞、精母细胞和圆形精子细胞。统计分析结果显示,与野生型相比,Sox30纯合突变雄鱼精巢中的精母细胞数量显著减少。与180 dah野生型雄鱼相比,纯合突变雄鱼的性腺成熟系数(gonadosomatic index,GSI)显著减小。利用巴氏染色对精子形态的分析表明,Sox30纯合突变雄鱼精子出现尾部变短、弯折和卷曲等畸形。运用计算机辅助精子分析系统检测精子活力的相关指标,发现与野生型雄鱼相比,Sox30纯合突变雄鱼精子的前向运动(PR)、平均直线运动速度(VSL)、平均路径速度(VAP)和摆动性(WOB)等精子活力指标都显著下降,非前向运动的精子比例显著升高。我们进一步将野生型和Sox30纯合突变雄鱼分别与野生型雌鱼进行人工授精,通过检测受精率来分析Sox30纯合突变对雄鱼育性的影响。结果显示,与野生型相比,Sox30纯合突变雄鱼的受精率显著降低。这些结果表明,Sox30缺失主要导致雄鱼部分精子尾部异常,精子运动能力下降,从而使突变雄鱼的育性降低。3.Sox30在尼罗罗非鱼精子发生中的作用机制(1)尼罗罗非鱼Sox30潜在靶基因的ChIP-seq筛选我们采用Ch IP-seq方法对尼罗罗非鱼精巢中Sox30的潜在下游靶基因进行了全基因组水平的鉴定筛选。根据ChIP-seq技术原理,将180 dah尼罗罗非鱼精巢组织分散成单细胞,将其固定后,利用核酸酶解法将细胞的基因组打断成100-900 bp大小的DNA片段,再利用Sox30的特异抗体免疫沉淀Sox30与基因组DNA结合而成的复合物,最后回收基因组DNA片段并进行高通量测序。结果显示,我们在尼罗罗非鱼Sox30的免疫共沉淀产物中共获得20,812,218 raw reads和20,635,915clean reads,在未进行Sox30免疫共沉淀的input对照组中共获得25,604,443 raw reads和25,316,577 clean reads。多序列比对分析显示,Sox30与尼罗罗非鱼精巢中潜在靶基因的结合基序主要为C(T/G/A)C(G/A/T)T(A/C/G)A(T/G/C)G(T/C)G(T/C/A)G(T/A/C)C(G/T/A)。与对照组相比,在Sox30免疫共沉淀物中共鉴定得到5,093个特异性Ch IP peaks,其中2,746个ChIP peaks定位在基因间隔区;1,738个和72个ChIP peaks分别定位于内含子和外显子区;537个Ch IP peaks定位于转录起始位点上游2.0 kb的启动子区,这537个峰对应499个潜在靶基因,其中包括Ift140、Ccdc180、Pgr和Rab3等精子发生相关基因。对499个Sox30潜在靶基因的GO功能分类显示,这些基因主要参与精子发生和受精等生物学过程。(2)Sox30敲除突变对尼罗罗非鱼精液蛋白质组的改变我们基于非标定量法(label-free)蛋白质组学测序分析了Sox30缺失突变对尼罗罗非鱼精液中蛋白质组的改变。分别收集3条野生型和Sox30纯合突变雄鱼的精液,提取总蛋白并开展蛋白质组测序。对测得的蛋白质组数据进行分析发现,与对照相比,Sox30纯合突变雄鱼的精液中有21个蛋白的表达发生上调,48个蛋白的表达显著下调,下调表达的蛋白中含有Rab-5a、Rab-5c、Rab7和囊泡运输蛋白Sec22b等可能参与精子鞭毛形成的蛋白。进一步的GO功能分析显示,差异表达蛋白主要参与蛋白定位、核糖核蛋白复合物的生物发生、蛋白质运输和囊泡组织等生物学过程及RNA结合、结构分子活性、核糖核蛋白复合物和碳水化合物激酶活性等分子功能。基于ChIP-seq和蛋白质组数据,我们进一步分析了利用Ch IP-seq鉴定的Sox30在180 dah雄鱼精巢中的499个潜在靶基因中是否包含利用蛋白质组学鉴定的差异表达蛋白的编码基因。有趣的是,我们发现Ccdc28a、Terf2ip和LOC109202134既是Ch IP-seq鉴定的Sox30潜在靶基因,其编码产物Ccdc28a、Terf2ip和LOC109202134又是野生型和Sox30纯合突变雄鱼精液蛋白质组中的差异表达蛋白。这些结果表明,Sox30可能通过直接调控Ccdc28a、Terf2ip和LOC109202134的表达来影响精子功能。上述基于蛋白组测序与ChIP测序获得的尼罗罗非鱼Sox30的潜在靶基因可为后续深入研究Sox30的作用机制奠定基础。4.Dmrt1对尼罗罗非鱼Sox30基因转录的调控鉴于Dmrt1在尼罗罗非鱼精巢高表达且决定雄性性别分化,我们进一步分析了Dmrt1对尼罗罗非鱼Sox30基因转录的潜在调控作用。性腺转录组数据分析表明,Sox30和Dmrt1在90 dah到300 dah尼罗罗非鱼的精巢中都高表达。Dmrt1敲降使尼罗罗非鱼精巢中Sox30的转录水平显著降低。克隆获得了尼罗罗非鱼Sox30基因翻译起始位点上游1,982 bp的启动子序列;序列分析发现,Sox30启动子区含有Dmrt1的顺式作用元件(CRE)。进一步的双荧光素酶报告基因实验证实,Dmrt1过表达显著提高了Sox30启动子的转录活性,Dmrt1顺式作用元件的突变则使Sox30启动子丧失了对Dmrt1过表达的应答。染色质免疫共沉淀PCR(Ch IP-PCR)和电泳迁移率实验分析(EMSA)表明,Dmrt1能与Sox30启动子中的顺式作用元件直接结合。这些结果表明,Dmrt1通过直接与Sox30启动子上的特异顺式作用元件结合来正调控尼罗罗非鱼Sox30的转录。综上所述,尼罗罗非鱼Sox30主要在精巢的精母细胞、圆形精子细胞、精子和输出精管上皮细胞及成熟精子中表达。Sox30纯合突变导致尼罗罗非鱼精子尾部异常,精子运动能力显著下降,从而使雄鱼育性降低。Sox30可能通过调控鞭毛内转运蛋白基因等精子发生相关基因的表达来影响尼罗罗非鱼精子发生,而Sox30的转录受到精巢高表达的Dmrt1的正调控。本研究有助于丰富和完善尼罗罗非鱼精子发生的分子调控机制,还可为动物雄性育性降低及不育的机理解析提供新的思路。