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嘧霉胺是一种内吸兼具熏蒸作用的苯胺嘧啶类杀菌剂,由于其对黄瓜和番茄等蔬菜的灰霉病均有很好的防治作用,不合理的施用导致果蔬类的嘧霉胺残留量经常超标,从而危害环境和人类的健康。现阶段,对嘧霉胺的残留检测方法有LC-MS、GC、BS和TLC等,但是这些方法有前处理复杂、对专业人员要求高和设备昂贵等缺点。所以应对嘧霉胺建立一种快速、灵敏、高效的检测方法。酶联免疫吸附测定（ELISA）方法具有上述优点外,同时还具有检测成本低、适合大量样品快速现场检测的需要。因此,酶联免疫分析技术对嘧霉胺残留检测具有实际意义。本研究探索了四条嘧霉胺半抗原（PMTH）的合成路线,并最终确定以对硝基苯胺和2-氯-4,6-二甲基嘧啶为起始原料,通过氨基取代、硝基还原和酯的氨解合成嘧霉胺半抗原,并得到经1H-NMR、TLC和MS的确证。采用混合酸酐法将PMTH和牛血清蛋白（BSA）偶联;采用活化酯法将PMTH和鸡卵清蛋白（OVA）偶联,经UV证明偶联物:PMTH-BSA（免疫原）、PMTH-OVA（包被抗原）均偶联成功,其中,PMTH与BSA的偶联比为14:1;PMTH和OVA的偶联比为6:1。将合成嘧霉胺免疫原和弗氏佐剂充分乳化至W/O状态,用达到W/O乳化状态的佐剂抗原免疫成年雄性新兰大白兔,首次免疫采用弗氏完全佐剂,免疫原有效剂量为0.5mg。每间隔两周增加一次实验兔的免疫,其余免疫次数采用弗氏不完全佐剂,免疫原有效剂量为175μg。当兔血清达到合理效价时即可采全血,用间接ELISA法测定末次免疫兔血清效价为64000。抗血清与氟啶胺、氯苯嘧啶醇、嘧啶肟草醚、双草醚、环酯草醚、嘧草醚和莠去津的交叉反应率均小于1%,抗血清的特异性较好。本试验采用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,并确定以包被抗原浓度为0.8μg/mL,抗体稀释倍数为4000的最佳工作浓度。抗体稀释至一定浓度分装在多个1mL离心管中,便于随取随用,防治反复冻融造成效价降低。确定试剂盒的最佳工作条件,在蒸馏水、生理盐水、磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐和柠檬酸-磷酸氢二钠六种缓冲液中,确定浓度为0.05mol/L、pH=9.6的碳酸盐缓冲液作为试剂盒最佳缓冲液;在0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1μg/m L六个浓度梯度的包被抗原中,确定0.6μg/m L浓度为最佳包被抗原浓度;在4oC和37oC两种包被温度和1、2、4、8和12h包被温度中,确定37oC下包被3h最佳包被温度和浓度的组合,若不考虑时间因素,亦可选择4oC下包被12h;在浓度为1%明胶、脱脂奶粉、BSA和OVA的PBS溶液中,确定1%明胶PBS作为最佳封闭物质;在1000、2000、4000、8000、16000和32000六个二抗稀释度中,确定1:2000作为二抗最佳稀释比例;在0.5、1、1.5、2和2.5mol/L硫酸中,确定2mol/L作为最佳终止液浓度;在筛选最佳竞争类型中,采用间接竞争ELISA为最佳竞争类型。HPLC确证ELISA试验及回收率试验中,ELISA平均回收率为96.58%,HPLC的平均回收率为104.28%,两者相符率达92.62%。参照嘧霉胺标准曲线,IC15的值为0.01μg/mL,确定为试剂盒检出限和灵敏度;板内变异和板间试验结果表明10-106ng/mL有良好的线性,说明试剂盒精确度较好。测定黄瓜、葡萄和番茄三种样品,作添加回收试验,试验结果表明试剂盒回收率为98.35%±11.84%。符合准确度的要求。