论文部分内容阅读
【研究目的】本课题拟研究在脓毒症状态下中性粒细胞的凋亡功能改变及表面抑制性分子PD-L1的变化,单细胞测序分析其亚型和生物学行为的改变,探讨中性粒细胞发挥免疫调节作用的分子机制。【研究背景】脓毒症是机体对感染的反应失控,而引起的的全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,并导致多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）和死亡,是当今外科重症监护室（intensive care unit,ICU）患者死亡的首要死亡原因之一,也是严重烧伤患者常见的并发症,甚至导致脓毒症休克或者死亡。近年来,尽管在严重脓毒症或脓毒性休克的抗感染治疗、创面处理和器官功能支持技术取得长足进展,脓毒症的病死率仍居高不下,高达30%～70%。据美国疾病控制和预防中心（Centers For Disease Control And Prevention）统计,每年美国有大概75万患者发生脓毒症,总费用估计约为167亿美元。中国重症监护临床试验集团（CCCCTG）的最新数据显示,37.3%的ICU住院患者诊断为严重脓毒症或感染性休克。其病情严重,治疗费用高,医疗资源消耗大,已严重影响人类的生活质量,对人类健康造成巨大威胁。脓毒症患者的免疫功能障碍,不能有效清除病原体,是脓毒症发病机制之一,也是感染难以控制的重要原因。因此,如何改善脓毒症患者免疫抑制功能,改善脓毒症患者的生活质量,改进脓毒症治疗措施,有效降低其死亡率,是脓毒症防治的重要课题。中性粒细胞在血液中大量存在,占白细胞总数的50%～70%,是先天免疫的重要细胞,也是抵御感染的第一道防线。细菌内毒素及炎症介质刺激下,诱发脓毒症,中性粒细胞的功能改变,不能有效清除病原体等,出现失控“瀑布样”炎症反应,免疫功能紊乱,引起全身各系统、多器官或组织的损害。因此,阐述脓毒症状态时中性粒细胞的功能改变,对免疫系统的影响及其机制,可为脓毒症的防治提供新思路和策略。程序性死亡蛋白-配体1（programmed cell death protein-ligand 1,PD-L1）是一种跨膜蛋白,被认为是免疫反应的共同抑制因子,它可以与程序性死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1,PD-1）相互作用,抑制其细胞的增殖,抑制抗原特异性免疫反应,从而抑制细胞因子的分泌,诱导凋亡。【研究方法】收集9例脓毒症患者感染期血液样本,及9例健康志愿者,将其分为健康对照组、脓毒症组,酶联免疫吸附法检测两组血清IL-6、TNF-α细胞因子表达;采用Ficoll密度梯度分离法分离纯化外周血中性粒细胞,台盼蓝染色检验细胞活性,流式细胞术检测严重脓毒症患者中性粒细胞的凋亡改变,以及中性粒细胞PD-L1（CD274）的表达。体外实验采用细菌内毒素LPS刺激小鼠骨髓中性粒细胞模型,LPS刺激外周血中性粒细胞模型,将其分别采用Percoll密度梯度离心法、Ficoll密度梯度离心法分离纯化中性粒细胞,分为正常对照组（Control）、LPS组,流式细胞术检测中性粒细胞凋亡率的改变,以及中性粒细胞PD-L1的表达;单细胞基因测序分析对照组（Control）、LPS组两组中性粒细胞亚群的改变、基因表达;基因芯片检测中性粒细胞基因表达的差异。信号通路验证部分,利用Percoll密度梯度离心法分离纯化小鼠骨髓中性粒细胞,将其分为正常对照组（Control）、LPS组、p38抑制剂+LPS组、MSK1i抑制剂+LPS组、MK2i抑制剂+LPS组,行总RNA的抽提与质检,进行转录组基因测序分析;分离提纯各组m RNA,进行RT-qPCR检测PD-L1的m RNA表达;提取纯化蛋白,蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）检测PD-L1蛋白、总p38α及其磷酸化蛋白表达、总MSK1及其磷酸化蛋白表达、总MK2及其磷酸化蛋白表达。【研究结果】临床病例研究发现脓毒症状态时的细胞因子表达增加,外周血中性粒细胞的凋亡功能受到抑制,清除感染能力降低。脓毒症患者外周血中性粒细胞表面分子PD-L1（CD274）表达升高。体外研究发现脓毒症状态下,LPS对中性粒细胞的凋亡具有明显的抑制作用,较正常对照组,其中性粒细胞表面分子PD-L1（CD274）表达升高。单细胞基因测序检测LPS刺激下中性粒细胞不同亚群,PD-L1为标志的中性粒细胞凋亡抑制,处于其分化终末阶段,具有免疫抑制作用。同时基因芯片检测脓毒症时中性粒细胞信号通路活化,LPS通过MAPK信号通路调控中性粒细胞表面分子PDL1的表达。运用p38 MAPK信号通路中关键抑制剂p38α、MSK1、MK2进行干预后发现,应用p38αi、MSK1i后中性粒细胞表面分子PD-L1（CD274）m RNA及蛋白的表达较LPS组降低,而应用MK2i后中性粒细胞表面分子PD-L1（CD274）m RNA及蛋白的表达较LPS组升高。【研究结论】本研究通过体内、体外研究发现脓毒症时中性粒细胞凋亡功能受到抑制,并分化为PD-L1高表达的亚群,LPS刺激后通过p38α-MSK1/-MK2信号通路调节中性粒细胞PD-L1的表达,从而调节免疫反应。