论文部分内容阅读
目的：
基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能的发病机制及骨碎补对骨髓间充质干细胞增殖和成骨-成脂分化的影响，为临床治疗提供理论依据。
方法：
第一部分临床实验研究
实验一：2015年5月至2016年4月从我院11例激素性股骨头坏死行人工关节置换术(实验组)和7例股骨颈骨折、股骨粗隆间骨折行人工关节置换或髓内固定术(对照组)患者术中从股骨近端抽取骨髓。实验经医院伦理委员会通过，术前每位患者均签署知情同意书。全骨髓培养法分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞，P3代用于实验研究。采用流式细胞仪进行表面抗原鉴定，CCK-8法、细胞周期检测两组细胞增殖情况，油红O染色鉴定其成脂能力，茜素红染色鉴定其成骨能力，RT-PCR和Western-blot检测各组骨髓间充质干细胞中Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子β-Catenin、CyclinD1、Runx2、PPAR-γ的mRNA和蛋白表达差异，基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能发病机制。
实验二：不同浓度梯度的骨碎补总黄酮干预P3代激素性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞，分为0g/L骨碎补总黄酮组、10-1g/L骨碎补总黄酮组、10-2g/L骨碎补总黄酮组、10-3g/L骨碎补总黄酮组、10-4g/L骨碎补总黄酮组、10-5g/L骨碎补总黄酮组、10-6g/L骨碎补总黄酮组、10-7g/L骨碎补总黄酮组，干预7天，检测各组细胞增殖率，得到最佳干预浓度用于下序实验研究。再分别用最佳干预浓度骨碎补总黄酮及经典成骨诱导剂干预P3代激素性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞，分为对照组、骨碎补总黄酮治疗组、经典成骨诱导剂组，干预21天后，检测各组ALP活性，茜素红染色及定量检定各组成骨能力，RT-PCR和Western-blot检测各组骨髓间充质干细胞中Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子Wnt10b、LRP5、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix的mRNA和蛋白表达差异，基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补对激素性股骨头坏死患者BMSCs增殖和成骨-成脂分化的影响。
第二部分动物实验研究
随机将160只雄性SD大鼠分为对照组、模型组和治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组各32只。给予模型组地塞米松磷酸钠(30mg/Kg,T.w.)臀肌注射。治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在模型组基础上同时给于骨碎补水煎剂正常浓度、浓缩5倍、浓缩10倍灌胃治疗，对照组采用生理盐水干预。12周后给予所有大鼠处死获取标本--股骨头组织和骨髓间充质干细胞用于检测。通过HE染色观察及ImageJ软件检测各组股骨头骨小梁面积、脂肪空泡面积及软骨厚度；通过股骨头轴向压力测试测定各组股骨头力学改变；通过全骨髓培养法体外分离、培养以上五组骨髓间充质干细胞，传代纯化，P3代用于实验研究。通过CCK-8、成骨-成脂定向诱导后Ⅰ型胶原SP染色、茜素红染色、油红O染色及定量、ALP定量检测五组大鼠P3代骨髓间充质干细胞增殖功能变化和成骨-成脂分化情况，并通过RT-PCR、WesternBlot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子Wnt10b、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix、PPAR-γ的mRNA和蛋白表达水平，进一步探讨基于Wnt/β-Catenin信号通路的激素性股骨头坏死可能的发病机制及骨碎补对BMSCs增殖和成骨-成脂分化的影响。
结果：
第一部分临床实验结果
实验一结果：1.两组hBMSCs细胞表面抗原检测结果:实验组各表面抗原(CD29、CD44、CD45、CD54、CD90)较对照组有显著性差异(P＜0.05)。
2.两组hBMSCs细胞增殖、细胞周期检测结果:实验组较对照组增殖能力明显下调(P＜0.05)。
3.两组hBMSCs细胞成骨-成脂定向诱导及定量检测结果:实验组较对照组成骨分化能力明显减弱，成脂分化能力增强，定量检测差异有统计学意义(P＜0.05)。
4.RT-PCR结果:实验组相较对照组Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、LRP5、β-Catenin、CyclinD1、Runx2mRNA的表达明显下调，成脂分化因子PPAR-γmRNA的表达明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，OsterixmRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。
5.WesternBlot结果：实验组相较对照组Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、β-Catenin、CyclinD1、Runx2蛋白的表达显著下调，成脂分化因子PPAR-γ显著上调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
实验二结果：1.不同浓度骨碎补总黄酮干预激素性股骨头坏死患者hBMSCs7天细胞增殖结果显示10-5g/L骨碎补总黄酮组细胞增殖率最高，与其他各组均有显著性差异(P＜0.05)，为最佳干预浓度。
2.ALP检测结果：较对照组，骨碎补总黄酮组(10-5g/L)和经典成骨诱导剂组干预1周、2周ALP活性明显增高(P＜0.05)；经典成骨诱导剂组ALP活性较骨碎补总黄酮组高，但两者无显著性差异(P＞0.05)。
3.三组SONFH患者hBMSCs干预3周茜素红染色及定量检测结果:对照组钙结节染色结果呈阴性，相较对照组，骨碎补总黄酮组和经典成骨诱导剂组茜素红染色可见大量阳性钙结节,定量检测有显著性差异(P＜0.05)；经典成骨诱导剂组和骨碎补总黄酮组钙结节定量检测有显著性差异(P＜0.05)。
4.三组SONFH患者hBMSCs各基因mRNA相对表达量RT-PCR检测结果：相较对照组，骨碎补总黄酮治疗组和成骨诱导剂组hBMSCsWnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、LRP5、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、OsterixmRNA的表达有显著性差异(P＜0.05)。骨碎补总黄酮组和成骨诱导剂组两者之间Wnt10、β-Catenin、Runx2、OsterixmRNA的表达有显著性差异(P＜0.05)；LRP5、CyclinD1mRNA的表达无显著性差异(P＞0.05)。
5.三组SONFH患者hBMSCs各蛋白相对表达量WB结果：相较对照组，骨碎补总黄酮治疗组和成骨诱导剂组hBMSCsWnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix蛋白表达有显著性差异(P＜0.05)。骨碎补总黄酮组和成骨诱导剂组两组之间β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix蛋白表达也有显著性差异(P＜0.05)。
第二部分动物实验研究结果
1.五组SD大鼠股骨头组织HE染色结果：与对照组相比，模型组骨小梁面积、最大软骨厚度明显减小，脂肪空泡面积明显增大，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组骨小梁面积和最大软骨厚度明显增大、脂肪空泡面积明显减少，差异均有统计学意义，尤其是治疗Ⅱ组效果最佳(P＜0.05)。
2.五组SD大鼠股骨头生物力学测试结果：相较对照组股骨头，模型组和治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组股骨头软骨下骨最大轴向载荷、应力强度及轴向刚度明显变弱，股骨头软骨下骨的最大位移明显增加，有显著性差异(P＜0.05)；相较模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组股骨头软骨下骨最大轴向载荷、应力强度及轴向刚度明显变强，股骨头软骨下骨的最大位移明显减小，有显著性差异(P＜0.05)，尤其以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显，二者之间无显著性差异。
3.五组SD大鼠rBMSCs增殖结果：五组SD大鼠rBMSCs增殖曲线均呈现“S”型。相较对照组，模型组细胞增殖曲线下调最明显，有显著性差异(P＜0.05)；相较于模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组细胞增殖曲线均上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，尤其以治疗Ⅱ、Ⅲ组上调明显。
4.五组SD大鼠rBMSCs成骨功能检测结果：Ⅰ型胶原SP染色、茜素红染色及定量、ALP活性检测结果显示相较对照组，模型组各指标明显降低；相较于模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组各指标明显增高，定量检测分析差异有统计学意义(P＜0.05)，尤其以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显，但二者之间差异无统计学意义(P＞0.05)。RT-PCR和WesternBlot结果显示相较对照组，模型组Wnt/β-Catenin信号通路主要因子及促进成骨分化因子Wnt10、β-Catenin、Runx2、OsterixmRNA及蛋白表达均有明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)；相较模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组各因子mRNA及蛋白表达均有明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，尤以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显。
5.五组SD大鼠rBMSCs成脂功能检测结果：相较对照组，模型组油红O染色明显增强；相较于模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组明显减弱，定量检测分析差异有统计学意义(P＜0.05)，尤其以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显，但二者之间差异无统计学意义(P＞0.05)。RT-PCR和Westernblot结果显示相较对照组，模型组Wnt/β-Catenin信号通路主要因子Wnt10、β-CateninmRNA及蛋白表达均有明显下调，PPAR-γmRNA及蛋白表达明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05)；相较模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组Wnt10、β-CateninmRNA及蛋白表达均有明显上调，PPAR-γmRNA及蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(P＜0.05)，尤以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显。
结论：
1.激素性股骨头坏死BMSCs增殖、成骨分化功能明显降低，成脂分化功能增强，符合“髓枯骨痿”中医理论，其机制可能与Wnt/β-Catenin信号通路抑制，Wnt10、LRP5、β-Catenin、CyclinD1、Runx2下调，PPAR-γ上调有关。
2.骨碎补可以通过促进激素性股骨头坏死BMSCs增殖、成骨分化功能，减弱成脂分化功能而发挥治疗作用，符合“肾主骨生髓，补肾壮骨”中医理论，其机制也可能与激活Wnt/β-Catenin信号通路，上调促增殖及成骨分化因子(Wnt10、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix)、抑制成脂分化因子(PPAR-γ)表达有关。
基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能的发病机制及骨碎补对骨髓间充质干细胞增殖和成骨-成脂分化的影响，为临床治疗提供理论依据。
方法：
第一部分临床实验研究
实验一：2015年5月至2016年4月从我院11例激素性股骨头坏死行人工关节置换术(实验组)和7例股骨颈骨折、股骨粗隆间骨折行人工关节置换或髓内固定术(对照组)患者术中从股骨近端抽取骨髓。实验经医院伦理委员会通过，术前每位患者均签署知情同意书。全骨髓培养法分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞，P3代用于实验研究。采用流式细胞仪进行表面抗原鉴定，CCK-8法、细胞周期检测两组细胞增殖情况，油红O染色鉴定其成脂能力，茜素红染色鉴定其成骨能力，RT-PCR和Western-blot检测各组骨髓间充质干细胞中Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子β-Catenin、CyclinD1、Runx2、PPAR-γ的mRNA和蛋白表达差异，基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能发病机制。
实验二：不同浓度梯度的骨碎补总黄酮干预P3代激素性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞，分为0g/L骨碎补总黄酮组、10-1g/L骨碎补总黄酮组、10-2g/L骨碎补总黄酮组、10-3g/L骨碎补总黄酮组、10-4g/L骨碎补总黄酮组、10-5g/L骨碎补总黄酮组、10-6g/L骨碎补总黄酮组、10-7g/L骨碎补总黄酮组，干预7天，检测各组细胞增殖率，得到最佳干预浓度用于下序实验研究。再分别用最佳干预浓度骨碎补总黄酮及经典成骨诱导剂干预P3代激素性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞，分为对照组、骨碎补总黄酮治疗组、经典成骨诱导剂组，干预21天后，检测各组ALP活性，茜素红染色及定量检定各组成骨能力，RT-PCR和Western-blot检测各组骨髓间充质干细胞中Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子Wnt10b、LRP5、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix的mRNA和蛋白表达差异，基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补对激素性股骨头坏死患者BMSCs增殖和成骨-成脂分化的影响。
第二部分动物实验研究
随机将160只雄性SD大鼠分为对照组、模型组和治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组各32只。给予模型组地塞米松磷酸钠(30mg/Kg,T.w.)臀肌注射。治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在模型组基础上同时给于骨碎补水煎剂正常浓度、浓缩5倍、浓缩10倍灌胃治疗，对照组采用生理盐水干预。12周后给予所有大鼠处死获取标本--股骨头组织和骨髓间充质干细胞用于检测。通过HE染色观察及ImageJ软件检测各组股骨头骨小梁面积、脂肪空泡面积及软骨厚度；通过股骨头轴向压力测试测定各组股骨头力学改变；通过全骨髓培养法体外分离、培养以上五组骨髓间充质干细胞，传代纯化，P3代用于实验研究。通过CCK-8、成骨-成脂定向诱导后Ⅰ型胶原SP染色、茜素红染色、油红O染色及定量、ALP定量检测五组大鼠P3代骨髓间充质干细胞增殖功能变化和成骨-成脂分化情况，并通过RT-PCR、WesternBlot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子Wnt10b、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix、PPAR-γ的mRNA和蛋白表达水平，进一步探讨基于Wnt/β-Catenin信号通路的激素性股骨头坏死可能的发病机制及骨碎补对BMSCs增殖和成骨-成脂分化的影响。
结果：
第一部分临床实验结果
实验一结果：1.两组hBMSCs细胞表面抗原检测结果:实验组各表面抗原(CD29、CD44、CD45、CD54、CD90)较对照组有显著性差异(P＜0.05)。
2.两组hBMSCs细胞增殖、细胞周期检测结果:实验组较对照组增殖能力明显下调(P＜0.05)。
3.两组hBMSCs细胞成骨-成脂定向诱导及定量检测结果:实验组较对照组成骨分化能力明显减弱，成脂分化能力增强，定量检测差异有统计学意义(P＜0.05)。
4.RT-PCR结果:实验组相较对照组Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、LRP5、β-Catenin、CyclinD1、Runx2mRNA的表达明显下调，成脂分化因子PPAR-γmRNA的表达明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，OsterixmRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。
5.WesternBlot结果：实验组相较对照组Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、β-Catenin、CyclinD1、Runx2蛋白的表达显著下调，成脂分化因子PPAR-γ显著上调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
实验二结果：1.不同浓度骨碎补总黄酮干预激素性股骨头坏死患者hBMSCs7天细胞增殖结果显示10-5g/L骨碎补总黄酮组细胞增殖率最高，与其他各组均有显著性差异(P＜0.05)，为最佳干预浓度。
2.ALP检测结果：较对照组，骨碎补总黄酮组(10-5g/L)和经典成骨诱导剂组干预1周、2周ALP活性明显增高(P＜0.05)；经典成骨诱导剂组ALP活性较骨碎补总黄酮组高，但两者无显著性差异(P＞0.05)。
3.三组SONFH患者hBMSCs干预3周茜素红染色及定量检测结果:对照组钙结节染色结果呈阴性，相较对照组，骨碎补总黄酮组和经典成骨诱导剂组茜素红染色可见大量阳性钙结节,定量检测有显著性差异(P＜0.05)；经典成骨诱导剂组和骨碎补总黄酮组钙结节定量检测有显著性差异(P＜0.05)。
4.三组SONFH患者hBMSCs各基因mRNA相对表达量RT-PCR检测结果：相较对照组，骨碎补总黄酮治疗组和成骨诱导剂组hBMSCsWnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、LRP5、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、OsterixmRNA的表达有显著性差异(P＜0.05)。骨碎补总黄酮组和成骨诱导剂组两者之间Wnt10、β-Catenin、Runx2、OsterixmRNA的表达有显著性差异(P＜0.05)；LRP5、CyclinD1mRNA的表达无显著性差异(P＞0.05)。
5.三组SONFH患者hBMSCs各蛋白相对表达量WB结果：相较对照组，骨碎补总黄酮治疗组和成骨诱导剂组hBMSCsWnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix蛋白表达有显著性差异(P＜0.05)。骨碎补总黄酮组和成骨诱导剂组两组之间β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix蛋白表达也有显著性差异(P＜0.05)。
第二部分动物实验研究结果
1.五组SD大鼠股骨头组织HE染色结果：与对照组相比，模型组骨小梁面积、最大软骨厚度明显减小，脂肪空泡面积明显增大，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组骨小梁面积和最大软骨厚度明显增大、脂肪空泡面积明显减少，差异均有统计学意义，尤其是治疗Ⅱ组效果最佳(P＜0.05)。
2.五组SD大鼠股骨头生物力学测试结果：相较对照组股骨头，模型组和治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组股骨头软骨下骨最大轴向载荷、应力强度及轴向刚度明显变弱，股骨头软骨下骨的最大位移明显增加，有显著性差异(P＜0.05)；相较模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组股骨头软骨下骨最大轴向载荷、应力强度及轴向刚度明显变强，股骨头软骨下骨的最大位移明显减小，有显著性差异(P＜0.05)，尤其以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显，二者之间无显著性差异。
3.五组SD大鼠rBMSCs增殖结果：五组SD大鼠rBMSCs增殖曲线均呈现“S”型。相较对照组，模型组细胞增殖曲线下调最明显，有显著性差异(P＜0.05)；相较于模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组细胞增殖曲线均上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，尤其以治疗Ⅱ、Ⅲ组上调明显。
4.五组SD大鼠rBMSCs成骨功能检测结果：Ⅰ型胶原SP染色、茜素红染色及定量、ALP活性检测结果显示相较对照组，模型组各指标明显降低；相较于模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组各指标明显增高，定量检测分析差异有统计学意义(P＜0.05)，尤其以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显，但二者之间差异无统计学意义(P＞0.05)。RT-PCR和WesternBlot结果显示相较对照组，模型组Wnt/β-Catenin信号通路主要因子及促进成骨分化因子Wnt10、β-Catenin、Runx2、OsterixmRNA及蛋白表达均有明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)；相较模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组各因子mRNA及蛋白表达均有明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，尤以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显。
5.五组SD大鼠rBMSCs成脂功能检测结果：相较对照组，模型组油红O染色明显增强；相较于模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组明显减弱，定量检测分析差异有统计学意义(P＜0.05)，尤其以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显，但二者之间差异无统计学意义(P＞0.05)。RT-PCR和Westernblot结果显示相较对照组，模型组Wnt/β-Catenin信号通路主要因子Wnt10、β-CateninmRNA及蛋白表达均有明显下调，PPAR-γmRNA及蛋白表达明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05)；相较模型组，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组Wnt10、β-CateninmRNA及蛋白表达均有明显上调，PPAR-γmRNA及蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(P＜0.05)，尤以治疗Ⅱ、Ⅲ组效果明显。
结论：
1.激素性股骨头坏死BMSCs增殖、成骨分化功能明显降低，成脂分化功能增强，符合“髓枯骨痿”中医理论，其机制可能与Wnt/β-Catenin信号通路抑制，Wnt10、LRP5、β-Catenin、CyclinD1、Runx2下调，PPAR-γ上调有关。
2.骨碎补可以通过促进激素性股骨头坏死BMSCs增殖、成骨分化功能，减弱成脂分化功能而发挥治疗作用，符合“肾主骨生髓，补肾壮骨”中医理论，其机制也可能与激活Wnt/β-Catenin信号通路，上调促增殖及成骨分化因子(Wnt10、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix)、抑制成脂分化因子(PPAR-γ)表达有关。