先天性巨结肠症(Hirschsprung disease,HSCR),又称肠无神经节细胞症(aganglionosis),是小儿外科常见疾病,占消化道先天发育畸形的第二位,是典型的肠神经系统发育异常疾病。HSCR最重要的病理特点是病变肠段肌间神经丛和粘膜下神经丛神经纤维增生伴神经节细胞缺如,肠道神经调节紊乱,以致受累肠段异常收缩,其近端结肠代偿性扩张与肥厚,形成巨结肠。先天性巨结肠的平均发病率约为1/5000,其中以亚洲人最高,高加索人最低。男女发生之比约为4:1,在短段型HSCR中这种性别差异尤其显著。现已证明HSCR是一种神经嵴病,与胚胎期神经嵴细胞迁移异常有关。因此,目前鉴定的HSCR相关基因,主要来自在肠神经系统发育中起主要作用的2个信号转导通路,RET信号通路和内皮素信号通路。迄今为止,已经发现了11个HSCR相关基因,即RET原癌基因(RET)及其配体胶质细胞源性神经生长因子基因(GDNF)和神经营养蛋白基因(NTN),内皮素受体B基因(EDNRB)及其配体内皮素3(EDN3)和内皮素转化酶1基因(ECE1),此外还有3个信号通路相关的转录因子基因:SOX10、ZFHX1B、PHOX2B,以及在神经系统发育中起重要作用的KIAA1279基因和TITF1基因。本课题应用病例-对照方法对RET基因上的12个单核苷酸多态性位点(singlenucleiotides polymorphisms,SNPs)和PHOX2B上的4个SNPs位点以及单体型与HSCR之间进行关联分析,对内皮素受体家族相关基因EDNRB、EDN3和ECE1进行突变筛选和相关多态性分析,探讨RET、PHOX2B、EDNRB、EDN3和ECE1基因在中国汉族儿童先天性巨结肠症发病中的作用。以上5个主要侯选基因与HSCR的相关性研究,为进一步阐明中国汉族人群HSCR发病的分子遗传学机制提供了实验依据。第一部分中国汉族人群散发性先天性巨结肠症与RET基因SNPs的关联性研究材料与方法:1.样本采集和基因组DNA抽提:根据2005年第四届国际巨结肠与相关神经嵴源性疾病会议的巨结肠诊断标准,重新阅片确定。选择HSCR患者125例,同时收集无消化道和神经嵴相关畸形的正常血标本(对照组)148例。本研究经浙江大学医学院伦理委员会批准,全部患儿及对照组均获得家长知情同意。基因组DNA抽提采用盐析法抽提,保存备用。2.SNPs的选择和分型:利用生物信息数据库查找目的基因的多态性位点(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/),共选取RET基因上位于外显子、内含子和5’UTR上的12个SNPs位点(SNP1～SNP12),和1个微卫星位点(Mint5),采用PCR-LDR法对所选SNPs和微卫星位点进行分型。3.RET基因和HSCR相关性的统计学分析包括:所测得基因型频率的Hardy-Weinberg在对照组中的遗传平衡检验;每一个SNP与HSCR之间在不同遗传模式下的相关性分析;不同SNPs标记之间的连锁不平衡分析;构建单体型,估算单体型频率以及不同单体型与HSCR的相关性分析。所有以上统计分析的显著性差异的P值水平为<0.05。结果:1.单个SNP与HSCR的相关分析结果显示:编码区的SNP8(rs1800858),SNP9(rs1800860)和SNP11(rs1800863)与HSCR发病存在显著差异(P<0.05),SNP10(rs1800862)在中国汉族人群中不具有多态性;非编码区的SNP1(rs741763),SNP2(rs2435365),SNP3(rs1864410),SNP4(rs2435364),SNP5(rs2435362),SNP6(rs752975),SNP7(rs2505535),SNP12(rs2075912)的相关等位基因频率在健康群体与HSCR群体间的分布存在极显著性差异(P<0.001)。HSCR患者中相关SNPs位点纯合子基因型频率明显高于对照人群,纯合子基因型OR值位于3.9-21.5之间,明显高于杂合子基因型。在中国先天性巨结肠症人群中,rs2505535的C等位基因、rs1800860的A等位基因和rs1800863的G等位基因可能具有保护性意义。在长段型HSCR病人和短段型HSCR病人间,rs2505535的C等位基因和rs1800860的A等位基因的分布频率存在显著性差异(P分别为0.015和0.006),其他SNPs在不同表型的HSCR病人间频率分布无显著性差异。根据最小AIC值,我们认为:SNP1、SNP4、SNP5和SNP6的最佳遗传模式为隐性;SNP2、SNP8、SNP11和SNP12的最佳遗传模式为加性;SNP3和SNP7的最佳遗传模式为共显性;SNP9的最佳遗传模式为显性。在中国汉族HSCR人群中,Mint5的(CA)_n频率分布与HSCR的发生不具有相关性。2.根据连锁不平衡分析结果,构建了两个由相邻位点存在显著相关(D’>0.75)的SNPs组成的单体型(SNP1/SNP2/SNP3/SNP4/SNP5/SNP6/SNP7/SNP8和SNP11/SNP12);3.不同单体型和HSCR的相关分析显示,单体型SNP1/SNP2/SNP3/SNP4/SNP5/SNP6/SNP7/SNP8和SNP11/SNP12都与HSCR存在显著的相关性,默认遗传模式为加性模式(P<0.0001)。结论:(1).首次对RET基因5’UTR到外显子2之间的非编码区SNPs与汉族HSCR患儿进行关联研究,结果显示这一区域内的非编码区SNPs与HSCR发病显著相关。(2).RET基因5’UTR到外显子2之间的某些非编码区功能性的SNPs位点在先天性巨结肠的发病中可能具有剂量依赖效应(dosage-dependent effect)。(3).位于PET基因5’末端和3’末端的2个单体型都与HSCR存在显著关联,实验结果提示PET基因是中国汉族HSCR患儿的主要易感基因。第二部分中国汉族人群散发性先天性巨结肠症EDNRB/EDN3/ECE-1信号通路相关基因的突变筛选和多态性分析材料与方法:1.样本采集和基因组DNA抽提:选择HSCR患者102例,同时收集无消化道和神经嵴相关畸形的正常血标本(对照组)43例。本研究经浙江大学医学院伦理委员会批准,全部患儿及对照组均获得家长知情同意。基因组DNA抽提采用盐析法抽提,保存备用。2.基因突变检测和SNPs分型:采用PCR-直接测序法对EDN3基因的3号外显子、EDNRB基因的全部七个外显子进行相关突变情况检测,对ECE1的2个SNPs位点(rs212529,rs212528)进行基因分型。3.EDNRB基因和HSCR相关性的统计学分析:包括所测得基因型频率的Hardy-Weinberg在对照组中的遗传平衡检验;每一个SNP与HSCR之间在不同遗传模式下的相关性分析。所有以上统计分析的显著性差异的P值水平为<0.05。结果:1.EDN3 exon3突变检测:102例HSCR样本中发现3例患者分别存在c373 C→T(L125L),c394 C→T(T132X),c406 G→A(G135R)单碱基的改变,而正常对照组不存在,分别为同义突变、无义突变和错义突变,突变率为0.029。2.EDNRB突变检测:102例HSCR样本和43例正常对照样本的EDNRB基因的exon1上发现3例患者存在c29G→A(R10H)单碱基的改变,而正常对照组不存在,为错义突变,突变率为0.029,国内外均未见报道该突变类型,因此认为R10H可能是中国人群特有的一个致病突变型。Exon2上发现3例患者存在c553G→A(V185M)单碱基的改变,而正常对照组不存在,为错义突变,突变率为0.029。Exon4上一例患者出现IVS4+16T→C单碱基改变。另外发现病例组与对照组均存在c831G→A(转换)单碱基的改变,属SNP位点,并且为同义cSNP,关联分析结果显示该位点与HSCR没有相关性。其他外显子上未发现突变位点。3.ECE1的rs212529和rs212528在超显性模式下与HSCR存在相关性。结论:(1).中国汉族人群散发性HSCR易感基因EDN3和EDNRB存在多种突变方式,以短段型为主,且均为杂合体突变,突变率分别为0.029和0.069。(2).EDNRB基因上检测到1个SNP位点,但与HSCR发病无相关性。实验结果提示,内皮素受体家族相关基因是中国汉族HSCR患儿的次要易感基因。第三部分中国汉族人群散发性先天性巨结肠症与PHOX2B基因多态性的关联性研究材料和方法:1.样本采集和基因组DNA抽提:选择HSCR患者102例,同时收集无消化道和神经嵴相关畸形的正常血标本(对照组)96例。本研究经浙江大学医学院伦理委员会批准,全部患儿及对照组均获得家长知情同意。基因组DNA抽提采用氯化铵法抽提,保存备用。2.基因突变检测和SNPs分型:采用PCR-直接测序法对PHOX2B基因的全部3个外显子的突变情况进行检测,并直接对相关SNP位点进行分型。3.PHOX2B基因和HSCR相关性的统计学分析包括:所测得基因型频率的Hardy-Weinberg在对照组中的遗传平衡检验;每一个SNP与HSCR之间在不同遗传模式下的相关性分析;不同SNPs标记之间的连锁不平衡分析;构建单体型,估算单体型频率以及不同单体型和HSCR的相关性分析。所有以上统计分析的显著性差异的P值水平为<0.05。结果:1.102例HSCR样本中只有一例碱基杂合:IVS2+31G→A,96例正常对照样本中未发现此序列改变。发现4个SNP位点:SNP1,c.701 A>G(首次发现);SNP2,IVS2+100A>G;SNP3,c.1121 A>C;SNP4,c.1124 del15;2.单个SNP和HSCR的相关分析结果显示,SNP1的G等位基因(P=0.022)和SNP2的G等位基因(P=0.005)在HSCR病人组中的分布频率明显大于正常对照组。SNP1和SNP2的最佳遗传模式为加性模式,未发现SNP3和SNP4位点与HSCR具相关性。SNP2的G等位基因在长段型HSCR病人和短段型HSCR病人间的频率分布存在显著性差异(P=0.014)3.根据连锁不平衡分析结果,构建了一个由相邻位点存在显著相关(D’>0.75)的SNPs组成的单体型SNP1/SNP2/SNP3/SNP4;3.单体型和HSCR的相关分析显示,A-G-A-N组合与HSCR存在显著的相关性(P=0.03),默认遗传模式为加性模式。结论:(1).PHOXB2B基因的c.701 A>G和IVS2+100 A>G多态性与中国汉族人群HSCR发病存在显著性相关性。且与疾病表型存在相关性。(2).PHOX2B基因c.701 A>G、IVS2+100 A>G、c.1121 A>C和c.1124 del15四个位点构成的单体型-AGAN是中国汉族HSCR人群的核心单体型。实验结果提示,PHOX2B基因可能是导致中国汉族儿童HSCR的易感基因。