研究背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病微血管并发症的重要类型,也是引起终末期肾脏疾病(end-stage renal disease, ESRD)的主要病因(约占40%～50%)。DN发病机制复杂,已有大量研究证实多元醇通路活性增高、糖基化终末产物形成增加、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)和肾素血管紧张素系统激活、GTP酶蛋白的活性变化、TGF-β-Smad信号通路的激活等细胞分子信号转导途径异常均参与了DN的发生与进展,但其具体的发病机制尚不完全清楚。目前临床上常用针对上述单个因子及信号转导分子的干预措施如PKC抑制剂等疗效有限。因此深入开展DN分子发病机制的研究,寻找DN新的治疗靶点,一直是国内外肾脏病学界研究领域的热点和难点。传统观念认为肾小球细胞损伤是DN的主要特征,但新近研究证实肾小管间质损伤在DN中具有重要的意义,且肾小管间质病变并不继发于肾小球病变,而是DN的早期和原始特征。肾小管上皮细胞损伤可导致肾小管重吸收和分泌功能异常,促进肾小管上皮细胞萎缩及肾间质纤维化。大量研究证实细胞过度产生活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)是糖尿病并发症发生发展的原始启动因子,ROS在高血糖诱导的肾小管上皮细胞损伤中起关键作用,其不仅可以直接引起肾小管细胞氧化损伤,还能激活多个细胞内信号因子及转录因子(如NF-κB等)而不断扩大高血糖诱导的细胞损伤,最终引起进行性的肾小球硬化和肾小管间质萎缩。因此,深入研究DN状态下ROS产生的调控机制具有重要意义。衔接蛋白P66Shc是诱导细胞氧化应激和凋亡,以及调控信号转导途径的重要分子,大量研究表明,P66Shc在衰老及代谢性疾病中起关键作用,其共同机制为P66Shc的缺失能加强机体对氧化应激的耐受与抵抗。本课题组既往研究发现DN患者外周血单个核细胞内P66Shc表达明显上升,体外研究证实P66Shc能通过调控线粒体动力学改变诱导肾小管细胞内ROS过度产生,从而加重高葡萄糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤。这些研究提示抑制P66Shc表达可能对延缓DN进展具有帮助作用。普罗布考是临床常用的降脂药物,近期研究表明普罗布考具有明显的肾脏保护效应。我们的预实验结果显示普罗布考预处理能降低高葡萄糖刺激体外培养的HK-2细胞中P66Shc的表达。因此我们推测在高葡萄状态下普罗布考可能通过调节P66shc基因表达进而参与调节氧化应激,保护高葡萄糖诱导的肾小管细胞氧化损伤。本试验将在本课题组以往研究的基础上,采用动物模型,细胞及分子生物学方法,研究P66Shc基因表达调控与DN肾小管间质损伤的关系以及普罗布考对实验性糖尿病肾病小鼠模型肾损伤保护作用的具体机制。旨在阐明普罗布考治疗DN肾小管细胞氧化损伤新的分子机制,并为DN的防治提供新的分子靶点。为此,本实验开展如下的研究。第一章糖尿病肾病患者肾组织组蛋白乙酰化水平与P66Shc表达的临床观察目的：观察DN患者肾组织中乙酰化组蛋白H3、组蛋白乙酰化酶P300、组蛋白去乙酰化酶SIRT1及氧化应激调控蛋白P66Shc表达及其与肾小管间质损伤间的关系。方法：随机选取DN及原发性肾小球轻微病变患者各8人,采用HE, Masson, PASM, PAS染色及肾小管间质损伤评分系统观察肾脏病理改变。免疫组化检测肾脏组织中Ac-H3, P300, SIRT1以及P66Shc的表达变化。结果：肾脏病理显示DN患者肾活检组织肾小球体积增大,部分出现结节性肾小球硬化,肾小球系膜基质增生,基底膜增厚；肾小管片状萎缩伴部分代偿性扩张,肾间质可见片状纤维化改变。对照组轻微病变患者肾小球基本正常,系膜细胞及系膜基质无明显增生,肾小管间质无明显纤维化,肾血管未见明显异常。DN患者肾小管间质损伤评分高于对照组。免疫组化检测显示：DN患者及对照组肾组织内均有AcH3, SIRTl, P300表达,且其主要表达在肾小管上皮细胞的细胞核内,肾小球细胞内也有一定量的表达；相对对照组,DN患者肾组织内SIRT1表达下调,P300表达稍上调。另外,DN患者及对照组肾组织内P66Shc主要表达在肾小管上皮细胞胞浆内,DN患者肾组织内P66Shc表达明显上调,尤其在肾小管间质纤维化较明显区域内P66Shc上调更为明显。相关性分析表明‘,肾小管间质内P66Shc表达水平与肾小管间质损伤评分呈正相关,而与SIRTl表达水平呈负相关。结论：DN患者肾组织(主要是肾小管内)P66Shc表达上调,SIRT1表达下调；P66Shc表达上调的同时伴随有肾组织肾小管间质损伤加重,提示组蛋白乙酰化修饰可能参与调控P66Shc表达,而P66Shc可能与糖尿病肾病肾小管间质损伤相关。第二章普罗布考通过调控P66Shc表达保护糖尿病肾病肾小管间质损伤的实验研究目的：探讨普罗布考对实验性糖尿病肾病小鼠肾损伤的治疗效应,以及普罗布考与组蛋白乙酰化修饰及P66Shc表达间的关系方法：使用ICR小鼠腹腔注射STZ构建糖尿病肾病模型,分别使用普罗布考及安慰剂隔日腹腔注射12周后处死小鼠,收集血标本及肾组织,通过生化检测肾功能,血糖,血脂；使用HE及Masson染色检测肾脏病理改变；DHE染色检测肾组织ROS水平,肾组织TUNEL原位染色检测细胞凋亡,及免疫组化、Western blot检测肾组织内SIRT1, P300, AcH3,P66Shc, FN蛋白表达,RT-PCR检测肾组织内P66Shc mRNA表达；MDA试剂盒检测肾组织匀浆中MDA浓度。采用不同浓度D-葡萄糖(5mM,30mM)及高糖(30mM)联合不同浓度普罗布考(20uM,40uM,80uM, DMSO对照)处理正常人近端肾小管上皮细胞株(HK-2),在不同时间点提取细胞RNA及蛋白质,通过细胞免疫荧光及Westem blot, RT-PCR检测普罗布考对高糖环境下HK-2细胞内P66Shc、FN、SIRT1, P300, AcH3蛋白质及mRNA表达的影响；MDA试剂盒检测细胞上清液中MDA浓度。结果：糖尿病肾病小鼠血清肌酐及血糖水平明显上调,肾组织内可见部分系膜基质增生,少数小管细胞空泡变性及刷状缘脱落,肾间质内可见纤维组织增生,肾组织ROS含量及肾小管上皮细胞凋亡明显增加,肾组织内P300, P66Shc,FN蛋白表达明显上升,AcH3表达无显著改变,SIRT1表达降低。与糖尿病肾病组小鼠相比,普罗布考干预组小鼠肾组织内间质纤维化程度、肾组织ROS及肾小管上皮细胞凋亡均减轻；P66Shc, FN蛋白表达降低；SIRT1表达升高,但普罗布考干预对肾组织内P300表达无明显影响。HK-2细胞经30mM葡萄糖处理后,细胞内氧化损伤程度明显增加；细胞内AcH3, P300, P66Shc,FN蛋白表达增强；SIRT1表达降低。普罗布考预处理可减轻HK-2细胞氧化损伤,上调SIRT1表达,降低P66Shc的表达,但对细胞内P300表达无明显影响。结论：普罗布考能下调STZ诱导的糖尿病肾病小鼠肾组织及高葡萄糖刺激的HK-2细胞内P66Shc的表达,增加SIRT1表达,并抑制ROS生成,减轻氧化应激引起的细胞损伤与肾小管间质纤维化。第三章普罗布考调控P66Shc基因启动子乙酰化修饰保护糖尿病肾病肾小管间质损伤的分子机制探讨目的：探讨普罗布考对高葡萄糖刺激的肾小管上皮细胞氧化损伤及凋亡的保护机制。方法：常规培养人近端肾小管上皮细胞株(HK-2),采用不同浓度D-葡萄糖(5mM及30mM)联合普罗布考(40uM)或AMPK的激动剂AICAR,AMPK抑制剂Dorsomorphin, SIRT1抑制剂EX-527处理。在不同时间点提取细胞RNA及蛋白质,通过Westem blot及RT-PCR检测普罗布考及相关激酶的抑制剂或激动剂对高糖环境下HK-2细胞内P66Shc、SIRT1、AMPK、p-AMPK蛋白及mRNA表达的影响。使用染色体免疫共沉淀检测分析普罗布考干预对P66Shc启动子区域组蛋白乙酰化表观遗传修饰的影响。结果：普罗布考干预后可明显上调高葡萄糖刺激诱导的HK-2细胞p-AMPK, SIRT1的表达,下调P66Shc的表达,使用AMPK抑制剂Dorsomorphin及SIRT1抑制剂EX-527预处理后,普罗布考下调P66Shc表达的效应明显降低。ChIP分析显示普罗布考能通过SIRT1进而下调P66Shc启动子-535bp至-276bp区域的组蛋白乙酰化程度,最终发挥下调P66Shc基因表达的效应。结论：普罗布考通过激活AMPK-SIRT1-AcH3通路降低P66Shc基因启动子-535bp至-276bp区域的组蛋白乙酰化程度,从而下调P66Shc基因转录及表达,保护高葡萄糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤和凋亡。