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该研究旨在大肠杆菌系统中获得高表达的重组人可溶性CD40L(rhsCD40L),主要内容结果如下:1.人sCD40LcDNA的克隆.针对人CD40L胞外区片段(Glu<,108>——Len<,261>)设计引物,以CD40L全长基因为模板,利用PCR技术进行可溶性CD40L基因片段的扩增,扩增后得到约480bp的片段,与文献报道的相符.将纯化后的PCR产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109.经蓝、白斑筛选及PCR、酶切鉴定,确定阳性重组子pGEM-T-sCD40L.2.表达载体pQE-40-sCD40L的构建.将pGEM-T-sCD40L以BamHI和Pst I双酶切,琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,与经相同双酶切的表达质粒载体pQE-40连接,经PCR,酶切鉴定,确定阳性重组子pQE-40-sCD40L.3.rhsCD40L的表达.pQE-40-sCD40L转化宿主菌E.coliM15进行表达,表达产物为包涵体形式.SDC-PAGE电泳显示,表达产物与诱导前及不含pQE-40-sCD40L的M15培养产物相比,在分子量为18kDa处有一特异条带,与理论值相符.经表达时间、诱导剂IPTG终浓度等条件的优化,rhsCD40L最高表达量可达26.7﹪.4.rhsCD40L包涵体的分离及洗涤.以溶菌酶及超声波处理破碎菌体,离心收集包涵体,加包涵体洗涤Buffer洗涤包涵体,目的蛋白的纯度可提高至68.5﹪.5.rhsCD40L的小量Ni-NTA亲和层析纯化.通过对洗脱缓冲液pH值、结合方式、加入咪唑、β-巯基乙醇等条件的优化,使纯化后的包涵体中目的蛋白含量达到96.5﹪.6.rhsCD40L的复性.用pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠配制复性液,采取分步稀释法将脲浓度降至1mmol/L,然后在4℃下,用蒸馏水进行分步透析,最终将蛋白液脲浓度降至1mol/L以下,上清液即为复性蛋白液.复性后的rhsCD40L经过对肿瘤细胞株SP<2>生长抑制实验,证实了具有生物活性.