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产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)为断奶仔猪和新生仔猪腹泻的重要病原体,其中以F4+产肠毒素性大肠杆菌对断奶和新生仔猪影响最大,因此预防F4+ETEC感染仔猪成为防治腹泻的关键一环。本研究以树突状细胞和M细胞靶向肽,作为乳酸杆菌基因工程疫苗的分子佐剂,口服接种产生有效地黏膜免疫,在胃肠道形成第一道有效防线,以抵抗产肠毒素性大肠杆菌对新生和断奶仔猪的侵害。同时探讨树突状细胞和M细胞靶向肽对黏膜免疫系统的影响。本研究首先利用实验室已有的F4+ ETEC STa-LTB-STb(K)融合基因,该基因为F4+ ETEC保护性抗原基因,在K基因的一端加上M细胞靶向肽col,获得靶向M细胞的基因KC。然后分别在KC基因两端加上树突状细胞靶向肽D基因。构建表达K88ac-STa-LTB-STb(K)、K88ac-STa-LTB-STb-col(KC)、D-K88ac-STa-LTB-STb-col(DKC)和K88ac-STa-LTB-STb-col-D(KCD)蛋白的pPG612.1-K//L.casei 393、pPG612.1-KC//.casei 393、pPG612.1-DKC//L.casei 393 和 pPG612.1-KCD/L.casei 393 重组乳酸杆菌。Western blot 和间接免疫荧光分析结果表明各融合基因在各重组乳酸杆菌中获得了表达,其中重组表达的目的蛋白KCD和DKC主要以分泌的形式存在。为研究双靶向修饰F4+ ETEC免疫保护性抗原蛋白的重组干酪乳杆菌系统作为活菌口服疫苗潜在的应用价值,本研究以5-7周龄的BALB/c小鼠为实验动物,进行了免疫学评价。分三次的免疫程序进行免疫,口服接种cfu=109活的乳酸杆菌菌量,以pPG612.1/L.casei393、pPG612.1-KC/L.casei 393和pPG612.1-K/L.casei 393 作为对照,分析 pPG612.1-DKC/L.casei 393和pPG612.1-KCD/L.casei 393组的免疫效果。实验表明目的蛋白无毒性,可诱导小鼠产生保护性免疫反应,M细胞和树突状细胞靶向肽修饰的重组蛋白与无靶向肽和单靶向肽组比可以诱导产生更高水平的特异性抗体IgG。这些结果表明所构建的保护性抗原是安全有效的,M细胞靶向肽和树突状细胞靶向肽抗原具有免疫增强作用。免疫后收集不同时间点的免疫小鼠的新鲜粪便、鼻腔冲洗液、外生殖道冲洗液样品,分别测定样品中特异性slgA含量。通过流式细胞术的方法检测Th1、Th2的表达水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况。口服免疫效果表明,免疫组 pPG612.1-DKC/L.casei 393 和 pPG612.1-KCD/L.casei 393G一免后第7d即可粪便及外生殖道中检测到较高水平的sIgA抗体,与对照组相比差异极显著(P<0.01),M细胞和DC靶向修饰组的免疫效果明显高于未修饰组pPG612.1-K/L.casei 93和单靶向修饰组pPG612.1-KC/L.casei 393;第三次免疫之后,pPG612.1-DKC/L.casei 393 和pPG612.1-KCD/L.casei 33在粪便、外生殖道及鼻腔冲洗液中均能检测到高水平的sIgA抗体,并在完成三次免疫后,特异性sIgA含量达到最高。组间差异极显著(P<0.01),与对照组差异极显著(P<0.01);以上结果表明,重组干酪乳杆菌系统能够刺激动物产生粘膜免疫应答和系统免疫应答,其中M细胞靶向肽和树突状细胞靶肽修饰组的抗体水平明显高于未修饰组。将新分离的免疫鼠肠系膜淋巴结稀释成5×106个/mL,经流式抗体检测T-helper细胞亚类Th1和Th2,分析M细胞靶向肽和树突状细胞靶向肽不同的修饰方式,对Th细胞的免疫调节的途径。结果显示,对M细胞和树突状细胞靶向肽修饰的乳酸乳杆菌,均发生了明显的平衡漂移,Th1/Th2小于1,说明在肠系膜淋巴结局部均发生明显的细胞免疫答。本实验构建了表达具有F4+ ETEC保护性抗原蛋白的重组干酪乳杆菌,证实M细胞靶向和树突状细胞双靶向策略在乳酸菌活载体疫苗系统中应用的有效性。确定了靶向策略可以产生更高的免疫增强效果,为下一步开发新型产肠毒素性大肠杆菌口服疫苗奠定了基础,也为探索双靶向传递抗原增强黏膜免疫应答水平实践与机理研究提供了基础材料。