论文部分内容阅读
我国是世界上小麦生产和消费的第一大国,小麦生产与国家粮食安全密切相关。在我国现实国情下,提高单产是确保小麦总产水平、保障粮食安全的根本出路。千粒重是小麦产量三要素之一,由粒长、粒宽和粒厚等要素组成,其高低与小麦产量直接相关。在小麦高产育种中,千粒重是人们关注的重要的目标性状之一。因此,通过现代分子生物学手段研究控制小麦籽粒大小的遗传基础、克隆粒重构成要素的相关基因、发掘优异等位变异并开发其功能标记对我国高产育种具有重要意义。小麦是异源六倍体(AABBDD),基因组庞大(16000Mb),重复序列含量很高(>80%)且无全基因组序列可供参考,从小麦中直接克隆基因难度较大、周期长,而对于呈数量性状遗传模式的产量相关性状基因的克隆则难度更大。因此,利用比较基因组学的原理和方法,参考模式植物产量相关基因研究成果,在小麦中克隆其同源基因,并通过反向遗传学的方法验证候选基因在小麦中的功能是条高效的途径。本文以控制水稻粒宽、粒重并对籽粒灌浆速率也有正向效应的DsGW2为候选基因,在小麦中克隆并研究了其同源基因TaGW2的功能,鉴定了该基因的优异等位变异并开发了其功能标记。同时,对TaGW2在小麦中调控粒宽和粒重的机理也进行了初步的研究。取得以下主要结论：1.通过分析我国小麦核心及微核心种质的粒长、粒宽、粒厚与千粒重的相关性得出,在粒重构成要素中以粒宽与千粒重的相关性最高(r=0.822)；此外,粒宽与千粒重的另一构成要素一粒厚也高度正相关(r=0.703)。2.克隆了小麦TaGW2 A.B.D基因组的cDNA及gDNA,并将其定位于小麦的第6部分同源群染色体上。TaGW2编码区与OsGW2在DNA及氨基酸水平的相似性分别>87%和>88%；TaGW2由8个外显子和7个内含子组成,与水稻及其它禾本科植物GW2结构相同；经功能预测,TaGW2编码一个424氨基酸组成的蛋白,该蛋白含有C5HC2型RING结构域,具有E3泛素连接酶的功能。3.不同粒宽、粒重品种TaGW2-6A,TaGW2-6B和TaGW2-6D编码区及内含子区的序列无差异。然而花后15d种子中TaGW2的表达量与小麦的千粒重呈负相关,这与OsGW2在水稻中对粒宽及粒重的负调控作用模式是一致的。由此可推断,TaGW2对小麦粒宽及粒重的调控作用可能与该基因表达调控区(启动子区)序列的差异有关。4.克隆了小麦TaGW2-6A、TaGW2-6B和TaGW2-6D上游～1.2kb的启动子区序列。以TaGW2-6A为参考,经预测-141位为该基因的转录起始位点TSS,-173位存在启动子的核心元件TATA Box。不同粒宽及粒重品种间在TaGW2-6B和TaGW2-6d启动子上游～1.2kb未发现DNA序列上的差异。然而,在taGW2-6A起始密码子上游-593和-739位的序列中,大粒组品种为-593A和-739G,而小粒组品种则由-593G和-739A构成。经大量测序表明,在现有品种中仅存在上述两种等位变异,且两个SNP在品种中成对出现,组成两个典型的单元型(Haplotype)。根据大粒组品种和小粒组品种两种等位变异在-593位置的碱基分别命名为：Hap-6A-A和Hap-6A-G。5.根据大粒型和小粒型TaGW2-6A等位基因在启动子区的序列差异,开发了以SNP-593差异为目标、以TaqI内切酶为工具的CAPS标记。通过扫描群体验证,该标记稳定、可靠且为共显性标记,为理想的TaGW2-6A等位基因的标记类型。6.通过候选基因关联分析的方法在小麦微核心种质群体中验证了TaGW2-6A对小麦粒宽及粒重的调控功能。关联分析结果显示,TaGW2-6A主要影响小麦粒宽和粒重,其生物学功能与OsGW2相似。大粒型等位变异Hap-6A-A与Hap-6A-G相比是一种优异等位基因类型,在现代育成品种中,前者较后者对千粒重的正向效应平均高3.1g左右,且平均早抽穗3.5d、早熟2.5d。因此,与Hap-6A-G相比Hap-6A-A是TaGW2-6A的优异等位变异类型,该基因的CAPS Marker可作为检测大粒、早熟基因的功能标记。利用RIL群体(小偃54/京411)将TaGW2-6A定位在小麦的6A染色体短臂的着丝粒附近,位于Xcfd80和Xbarcl46之间。这与以往检测到的小麦6A染色体上的控制粒宽及千粒重的QTL位点相吻合,通过比较定位结果进一步证明了TaGW2-6A对小麦粒宽及千粒重的调控功能。7.比较地方品种和育成品种中TaGW2-6A等位变异在不同麦区的频率变化可知,大粒形等位变异Hap-6A-A在不同麦区均被正向选择利用,表明该基因的应用不受生态环境的限制。目前在我国小麦品种中,Hap-6A-A已成为优势等位基因类型,而欧洲小麦品种中则以Hap-6A-G为主。8.研究了TaGW2-6A两种等位变异类型品种在小麦花后5d和10d种子中TaGW2表达量的差异发现,在Hap-6A-G品种中, TaGW2在花后5d和10d的平均表达量均高于Hap-6A-A型品种,这与TaGW2通过表达水平负调控小麦粒宽和粒重的推论相吻合。对TaGW2-6A两种等位变异上游～2.9kb的启动子顺式作用元件差异进行了预测。与Hap-6A-G相比,在Hap-6A-A中含有更多已鉴定的顺式作用元件,其中-2070位C/T的不同使得Hap-6A-A在该位点为胚乳组织特异性表达的作用元件(GCN4_motif),而在Hap-6A-G中该位点则为ABA响应元件(ABRE)。然而,关于TaGW2-6A启动子区SNP对该基因表达水平的影响尚待进一步验证。