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目的:疫苗是预防传染性疾病最经济、有效的手段,其主要及成分是各种减毒或灭活的病毒、细菌、类毒素和蛋白等生物活性物质,它们对温度极其敏感,因此从疫苗的生产到运输过程都需要严格的低温保存,这大大增加了疫苗的使用成本,限制了疫苗的广泛应用。肺炎链球菌（streptococcus pneumonia,S.pn）是社区获得性肺炎的主要致病菌,同时还能够引起鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎等,而疫苗是控制其感染致病的主要手段。蛋白质疫苗由于其保守性高,能有效地激活B、T细胞免疫,成为目前疫苗研发的热点,但是所有的蛋白质疫苗有共同的缺陷,即对热的不稳定性,这在很大程度上限制了蛋白质制品的实际应用。因此,提高蛋白质的稳定性对蛋白质疫苗的应用具有非常重要的意义。本研究拟以S.pn溶血毒素PLY和热休克蛋白DnaJ为基础,利用仿生矿化技术制备出具有生物矿化能力的S.pn蛋白疫苗。通过生物矿化为其包裹上一层CaP外壳以提高其稳定性,并探讨该方法是否在蛋白质制品中具有广泛的应用价值。方法:通过分子克隆技术表达并纯化蛋白WT-PLY、ΔA146PLY和DnaJ以及含有生物矿化肽的蛋白WT-PLY-PA44、ΔA146PLY-PA44和DnaJ-PA44,在富含Ca2+和PO43-的弱碱性溶液中进行生物矿化;通过TEM、EDS等分析矿化颗粒的大小及表面成分;通过蛋白酶K降解实验、溶血实验等分析矿化疫苗的热稳定性;通过细胞实验及动物实验评估矿化疫苗的免疫保护效果。结果:成功制备重组蛋白WT-PLY、ΔA146PLY和DnaJ以及其对应的含有生物矿化肽的蛋白WT-PLY-PA44、ΔA146PLY-PA44和DnaJ-PA44,且纯度达到90%以上。不管是未连接矿化肽的蛋白WT-PLY、ΔA146PLY和DnaJ,还是连接上矿化肽的蛋白WT-PLY-PA44、ΔA146PLY-PA44和DnaJ-PA44,经过生物矿化后,原本澄清透明的蛋白液变为矿化蛋白悬液且呈乳白色;并初步构建具有密度较均一的矿化颗粒:WT-PLY@CaP、ΔA146PLY@CaP和DnaJ@CaP,大小分别为123.01±2.49 nm、115.09±2.43 nm和85.09±5.02 nm,WT-PLY-PA44@CaP、ΔA146PLY-PA44@CaP和DnaJ-PA44@CaP,大小分别为90.12±2.73 nm、108.21±3.43 nm和95.02±2.74 nm。蛋白酶K降解实验结果显示,未矿化蛋白随着时间的延长基本降解,但是矿化蛋白仍然有较多残留;从降解速率上来看,矿化后的蛋白降解速率都较未矿化蛋白显著降低,提示矿化蛋白相较于未矿化蛋白有更高的蛋白酶K耐受性。WT-PLY以及WT-PLY-PA44的溶血实验结果显示,矿化蛋白可以在45°C下保留其溶血活性至24 h,在55°C下保持其溶血活性至10 min;而未矿化蛋白则只能在45°C下保留其溶血活性至30 min,在55°C下保持其溶血活性至3 min,这提示矿化蛋白在较高温度下的热稳定性较未矿化蛋白高。细胞检测实验结果显示,矿化蛋白纳米颗粒体外刺激抗原提呈细胞分泌的IL-6和TNF-α水平均较未矿化蛋白的显著升高;而动物实验结果显示,矿化纳米颗粒免疫组均较未矿化蛋白免疫组诱导小鼠产生更高效价的特异性抗体,鼻腔攻毒后其菌载量均较未矿化蛋白免疫组显著降低,小鼠产生的炎性因子IL-6和TNF-α水平也较未矿化蛋白组显著降低。结论:本研究通过较为简便的生物矿化技术对疫苗蛋白进行生物矿化,不管蛋白连接矿化肽与否,蛋白都可以形成具有CaP矿化外壳的纳米颗粒,但是连接上矿化肽的蛋白其矿化效率更高。最终形成的纳米颗粒具有一定的抗蛋白酶K降解能力和高温耐受性,这些结果为稳定性蛋白质制剂的制备提供了有价值的实验依据。