目的观察胶联羊膜治疗兔角膜化学性碱烧伤及深层损伤的效果,探讨其促进角膜损伤愈合的机制,为胶联羊膜临床应用奠定理论及实验基础。本研究分为3部分:实验一:胶联羊膜治疗角膜碱烧伤的实验研究实验二:胶联羊膜治疗角膜深层损伤的实验研究实验三:DTAF标记胶联羊膜移植转归的实验研究方法实验一:新西兰大白兔60只,随机分为3组,A组:单层胶联羊膜组;B组:单层普通羊膜组;C组:对照组,每组20只。浸有1mol/lNaOH的圆形滤纸片贴于兔角膜表面,建立重度碱烧伤模型,4-6小时内按分组行羊膜覆盖术。术后观察结膜充血水肿、羊膜溶解脱落、角膜水肿混浊等情况,并对新生血管、角膜透明度进行评分;荧光素染色照相,计算机图象分析系统定量测定角膜上皮愈合面积。术后第7、14、28、42d,每组处死5只动物,取角膜行组织病理学检查,免疫组织化学方法半定量检测角膜中TGF-β1、MMP-2的表达。实验二:新西兰大白兔45只,随机分为3组,A组:双层胶联羊膜组;B组:普通双层羊膜组;C组:损伤对照组,每组15只。用直径7.5mm角膜环钻在角膜中央划痕,沿划痕剔除1/2厚度板层角膜,建立兔角膜深层损伤模型,4小时内按分组行羊膜移植术。术后观察羊膜溶解脱落时间、角膜愈合情况、新生血管及角膜透明度。第7、14、28d,每组取5只角膜行组织病理学检查,TUNEL法检测角膜基质凋亡细胞,并计数PMNS。实验三:新西兰大白兔5只,按实验二中方法建立角膜深层损伤模型。双层胶联羊膜用0.5%DTAF荧光标记后,移植于角膜创面,再在其上覆盖一层起保护作用的单层羊膜,并缝合固定于浅层巩膜。术后每日观察羊膜及角膜大体情况,第7、15、30、60、90d各处死一只动物,取角膜平分为两份,一份送透射电镜检查,另一份冰冻切片后行激光共聚焦显微镜检查及HE染色组织病理学检查。结果实验一:1.羊膜溶解脱落时间:胶联羊膜完全溶解脱落的时间为21.00±2.418d,而普通羊膜为12.20±2.618d,两种羊膜溶解脱落时间存在显著差异(P<0.01)。2.角膜基质PMNS浸润:角膜碱烧伤后各时间点,胶联羊膜组角膜基质中PMNS明显少于对照组(P<0.05),而普通羊膜组仅在碱烧伤后第7、14d较对照组减少(P<0.05),其它时间点则无显著差异(P>0.05)。3.角膜新生血管评分:胶联羊膜组角膜新生血管评分平均值在术后第14、28、42d时,与损伤对照组比较均有显著差异(P<0.01),而普通羊膜组虽然低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。4.角膜混浊度评分:胶联羊膜组及普通羊膜组角膜混浊度评分平均值在术后14d时均与对照组无显著差异(PA=0.435,PB=0.196);胶联羊膜组角膜浑浊度评分平均值在术后第28、42d时明显低于对照组(P<0.01),而普通羊膜组仅在术后第42d时低于对照组(P<0.05)。5.角膜上皮愈合时间:术后第14、28、42d时,胶联羊膜组及普通羊膜组角膜上皮愈合面积均明显多于对照组(P<0.05),但三个时间点,两羊膜组上皮愈合面积组间差异具有显著性(P<0.05)。6.角膜基质TGF-β1的表达:胶联羊膜组及普通羊膜组在术后第7、14d时角膜基质中TGF-β1的表达均明显低于对照组(P<0.05),两羊膜组组间差异无显著性(P7=0.523,P14=0.446)。术后28、42d,胶联羊膜组角膜基质中TGF-β1的表达明显低于对照组(P<0.05),而普通羊膜组与对照组比较,差异无统计学意义(P28=0.519,P42=0.179)。三个实验组术后各时间点角膜基质中TGF-β1的表达均较正常角膜明显增高(P<0.05)。7.角膜基质MMP-2的表达:术后各时间点三个实验组角膜基质中MMP-2的表达均较正常角膜增高,其中胶联羊膜组角膜基质中MMP-2的表达在术后第7、14、28d时较对照组明显降低(P<0.05),而普通羊膜组仅在术后第7、14d时较对照组低(P<0.05)。两羊膜移植组间差异具有显著性(P=0.000)。术后第42d时,两羊膜组角膜基质中MMP-2的表达与对照组比较,差异无统计学意义(PA=0.2148,PB=0.4132)。8.角膜溃疡穿孔情况:整个观察期,胶联羊膜组无一例角膜发生穿,而普通羊膜组和对照组分别有2例和3例发生角膜溃疡穿孔。实验二:1.胶联羊膜移植后可较长时间紧密覆盖于创面不溶解脱落,而普通双层羊膜移植后3-5天即出现羊膜层间积液,继而导致羊膜溶解脱落。2.胶联羊膜组无一例角膜穿孔,角膜全部恢复正常厚度,保持了一定的透明性,新生血管和瘢痕化程度轻,角膜基质中胶原纤维排列整齐。普通双层羊膜组和对照组分别有3例和2例角膜穿孔,角膜新生血管粗大,瘢痕致密,胶原纤维结构紊乱。3.胶联羊膜组角膜基质中凋亡细胞在术后各观测时间点均较损伤对照组明显减少(P<0.05),而普通双层羊膜组仅在术后7d时与损伤对照组存在显著差异(P<0.05)。术后7d,胶联羊膜组和普通羊膜组角膜基质中PMNS数量均较损伤对照组明显减少(P<0.05),两羊膜移植组间差异具有显著性(P<0.01)。实验三:1.角膜表面起保护作用的单层羊膜术后1w内基本溶解脱落,暴露出角膜创面嵌合的黄色胶联羊膜。随时间推移,胶联羊膜部分溶解,角膜创面逐渐修复。至术后30d时,可见角膜创面残留有局限浅黄色瘢痕,约高出于眼表,通过肉眼和裂隙灯检查无法准确判断其性质,但至观察结束时,角膜透明度有所提高,眼表光滑,隐约可见此浅黄色痕迹。2.组织病理学观察显示,术后7d时,胶联羊膜与角膜创面贴合紧密,角膜创缘交界处上皮细胞已分裂为9-13层,表层的扁平上皮细胞沿胶联羊膜的上下两层及中间的纤维蛋白胶移行,部分移行细胞已分裂为2层细胞结构;术后15d时,纤维蛋白胶已降解,移行的上皮细胞完全将羊膜覆盖,分裂为2-3层复层上皮,角膜创面厚度略高于正常角膜,角膜基质中成纤维细胞增殖活跃并分泌大量胶原将羊膜基质包裹。术后30d时,角膜厚度基本恢复正常,上皮细胞完整均匀一致,为5-7层复层上皮与角膜前基质紧密连接。羊膜基质结构完整清晰,其周围无巨噬细胞及炎细胞浸润。至术后60d和90d时,角膜厚度恢复正常,上皮细胞完整,前弹力层缺损,基质胶原排列整齐,偶见管腔完整的新生血管,角膜基质中羊膜结构较前无明显变化。3.激光共聚焦显微镜观察到胶联羊膜移植后各时间点,角膜基质中均可见黄绿色荧光羊膜条带,其荧光强度及宽度随时间无明显变化,周围角膜基质中无黄绿色荧光渗漏。4.透射电镜观察示整合于角膜基质中的羊膜及其周围的角膜基质超微结构未发生明显改变,修复的角膜上皮细胞与基质连接紧密,形成桥粒或半桥粒连接。结论1.对于角膜化学性碱烧伤,胶联羊膜较普通羊膜具有更好的治疗效果,它可以明显延长羊膜在角膜创面的覆盖时间,抑制碱烧伤后PMNS对角膜基质的浸润,抑制角膜基质中TGF-β1及MMP-2的表达,促进上皮愈合,稳定眼表。它可以发挥羊膜及纤维蛋白胶的双重治疗作用,抑制角膜基质溶解,防止角膜溃疡形成或穿孔,抑制碱烧伤后角膜新生血管形成,减轻瘢痕程度,提高角膜透明性。2.胶联羊膜对角膜深层损伤具有较好的治疗效果,它不仅可以补充角膜基质中破坏的胶原,封闭创面,为角膜上皮提供健康的基底膜,还可以抑制角膜细胞凋亡及PMNS浸润,减轻新生血管及瘢痕形成。3.胶联羊膜移植于角膜深层创面后,随时间推移,纤维蛋白胶完全降解,而羊膜却伴随着角膜创面修复包裹于角膜基质中,成为角膜结构的一部分。整合于角膜基质中的羊膜并不会很快溶解吸收,也不会引起角膜炎症和排斥反应。这种现象提示,胶联羊膜在一定程度上有可能替代板层角膜材料,胶联羊膜移植可能成为治疗角膜溃疡或深层损伤的一种新的有效方法。