第一部分Notch1-RBP-Jκ信号通路与动脉中膜钙化的关系目的：明确Notch1-RBP-Jκ信号通路和血管平滑肌细胞钙化的相关性。方法：建立钙化模型,按钙化干预时间分为钙化0天、7天和14天三组。应用von kossa染色、钙离子含量测定、碱性磷酸酶(ALP)活性并检测Msx2表达以明确VSMCs成骨样转化；RT-PCR和western blot检测Notch1、RBP-Jκ mRNA和蛋白表达、免疫组化检测N1-ICD蛋白以明确Notch1—RBP-Jκ信号通路表达和激活。结果：von kossa染色显示VSMCs钙化模型中钙沉积随钙化干预时间延长而增加：钙化7天组可见少量散在钙沉积,钙化14天组有明显黑色钙沉积。随钙化干预时间增加钙离子含量表达上升：钙化14天组表达最高(P<0.05)。Notch1、RBP-Jκ mRNA和蛋白均随钙化程度增加表达上升,钙化14天组表达最高(P<0.05),Msx2表达在钙化14天组表达最高(P<0.05)。免疫组化结果显示N1-ICD蛋白表达也随钙化程度增加而增加。结论：动脉中膜钙化过程中,Notchl-RBP-Jκ信号通路表达增加并被激活,其表达同VSMCs钙化程度呈正相关。第二部分Notch1-RBP-Jκ信号通路对动脉中膜钙化的影响目的：探讨抑制Notch1信号通路对VSMCs钙化的影响。方法：建立VSMCs钙化模型和Notch1信号抑制模型(DAPT:Notch1信号抑制剂)。按干预时间分为六组,分别为钙化0天组、7天组和14天组,与DAPT0天组、7天组和14天组。检测Notchl、RBP-Jk mRNA和蛋白表达及Nl-ICD蛋白表达,明确Notchl—RBP-Jk信号通路激活情况。检测VSMCs钙盐沉积程度(von kossa染色、钙离子含量测定)和检测钙调节相关标志物(ALP活性、Msx2含量),明确VSMCs成骨样转化程度。结果：加入DAPT后,DAPT组与干预相同时间的钙化组相比,Notch1、RBP-Jκ mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05),免疫组化显示N1-ICD下调,Notchl信号通路受抑制。von kossa染色可见,同干预相同时间钙化组相比,DAPT14天组钙盐沉积程度明显减轻,钙离子含量和ALP活力下降(P<0.05),成骨样转化转录因子Msx2表达下降(P<0.05)结论：抑制Notchl信号表达和激活,动脉中膜钙化受抑制。第三部分骨保护素在动脉中膜钙化过程中对Notch1-RBP-Jκ信号通路的作用目的：骨保护素(OPG)在动脉中膜钙化过程中对Notch1-RBP-Jκ信号通路的作用。方法：本实验中VSMCs被分为四组：钙化组、OPG组1(0.1ng/ml)、OPG组2(1ng/ml)和OPG组3(10ng/ml)。干预14天后,应用von kossa染色、钙离子含量测定、碱性磷酸酶(ALP)活性并检测Msx2表达以明确VSMCs成骨样转化；QT-PCR和、vesterr blot检测Notch1、RBP-Jκ mRNA和蛋白表达、免疫组化检测Nl-ICD以明确Notch1-RBP-Jκ信号通路表达和激活。结果：同钙化组相比,OPG干预组von kossa染色黑色钙盐沉积明显减轻,钙离子含量、ALP活性和Msx2表达,均随OPG干预浓度的增加明显下降(P<0.05)。Notch1、 RBP-Jκ蛋白和mRNA水平表达也随OPG浓度增加而减少(P<0.05)。结论：OPG可抑制血管平滑肌细胞钙化发生,同时抑制Notch1-RBP-Jκ信号表达和激活,其效应呈现浓度依赖性。第四部分阿仑膦酸钠在动脉中膜钙化过程中对Notch1信号的作用目的：探讨阿仑膦酸钠(alendronate, ALN)在动脉中膜钙化过程中对Notch1-RBP-Jκ信号通路的作用。方法：VSMCs按照不同干预被分为七组：对照组、钙化组、DAPT组、ALN组1(10-8mmol/1)、ALN组2(10-6mmol/1)、ALN组3(10-4mmol/1)和ALN组4(10-3mmol/1)。干预14天后应用von kossa染色、钙离子含量测定、碱性磷酸酶(ALP)活性、Msx2表达以明确VSMCs成骨样转化；QT-PCR和western blot检测Notch1、 RBP-Jκ mRNA和蛋白表达、免疫组化检测N1-ICD以明确Notch1信号通路表达和激活。结果：同钙化组相比,von kossa染色证实钙盐沉积随ALN干预浓度增加明显减轻,钙离子含量、ALP活性和Msx2表达也随ALN浓度增加下降(P<0.05),并于10-4mmol/1时达到最大抑制程度。同时,细胞中Notch1、RBP-Jκ转录和翻译水平也随ALN浓度增加而下调(P<0.05)。结论：ALN具有抑制血管平滑肌细胞钙化,并抑制Notch1信号表达和激活,其效应呈现浓度依赖性。