沼气工程的推广应用在保护生态环境和减少温室气体排放等方面具有重要的意义。在农村地区发展户用沼气工程能够改进农村能源使用途径,治理农业面源污染和促进农业生态的良性循环。沼气发酵生态系统中大量的原核生物与系统的高效稳定运行有着密切关系。沼气发酵过程中的工艺参数和原料来源等环境因子从多方面影响着发酵系统中原核生物的数量、群落结构和群落功能,而原核生物的代谢活动反过来又会影响沼气发酵生态系统的稳定运行。因此,沼气发酵系统中原核生物的群落结构组成对产气效率起着十分重要的作用。目前,云南农村户用沼气池数量多,但沼气池在管理和使用过程中仍然存在许多问题,如沼气池产气不稳定、产气量少、冬季停用现象。针对云南农村户用沼气池的问题,目前的研究主要从工程角度出发,多集中在沼气池的工艺参数优化、保温措施和活性污泥驯化等方面研究上,但是对云南农村户用沼气发酵生态系统的重要生物因素—原核生物及其与环境因子相关性的研究几乎无人涉及。因此,对云南农村户用沼气发酵生态系统中原核生物的群落结构和功能、原核生物与环境因子相互关系的研究十分有意义。通过生态因子综合分析,揭示沼气发酵系统中原核生物群落的演替规律等基本生态学问题,能够为设计具有应用前景的高效沼气发酵系统,活性污泥驯化,发酵条件提供最优监控方案和规模化应用奠定基础。本研究是从云南4个不同气候类型与地理区域的代表性农村户用沼气发酵池中采集活性污泥,用Illumina高通量测序技术,系统地分析云南不同气候类群与地理区域的农村户用沼气池中原核生物的类群组成、群落结构和群落功能,并阐述其与环境中非生物因子间的相关性,进而探讨不同气候区域的沼气池中原核生物群落空间动态(地理格局)分布。其次,运用DGGE和Illumina高通量测序技术,研究模拟云南热带气候区域的农村户用沼气发酵过程中原核生物群落的时间动态变化。深入分析整个过程中原核生物群落结构,探讨原核生物群落在时间上的动态演替规律。研究结果显示,云南农村户用沼气发酵生态系统中存在丰富的原核生物类群。在不同气候类型与地理区域的沼气发酵生态系统中,原核生物群落结构存在较大差异。在模拟沼气发酵过程中,不同的原核生物类群的动态变化规律不一样。1.云南农村户用沼气发酵生态系统中存在丰富的原核生物类群。Illumina高通量测序结果显示,云南4个不同气候区域的农村户用沼气生态系统中存在着丰富的细菌和古菌类群。从10个沼气池中平均获得61,000多条有效序列,聚类分析发现发酵系统中有16个已知门类群：泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿菌门(Chlorobi)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、Synergistetes、热袍菌门(Thermotogae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和Caldithrix等和5个候选门类群。其中,厚壁菌门(Firmicutes)、广古菌门(Euryarchaeota)和拟杆菌门(Bacteroidetes)在该生态系统中占着绝对的优势地位。2.PCA结果显示,不同气候区域的沼气发酵系统中原核生物的群落结构存在差异,同一气候区域的原核生物群落结构相近。厚壁菌门(Firmicutes)所占的比例范围为22-55%,其中它在北温带的XGP2和XGP3比例最高,分别为54.6%和41.1%。广古菌门(Euryarchaeota)的丰度变化范围为4.1%到46%,同样差异明显。与厚壁菌门(Firmicutes)丰度相反,广古菌门(Euryarchaeota)在XGP2和XGP3中比例最低,仅为8.5%和4.1%。拟杆菌门(Bacteroidetes),在各个样点中的丰度存在差异,为10-27%。原核生物的群落结构与沼气发酵系统的产气量存在一定的相关性。3.应用DGGE指纹图谱技术研究模拟沼气发酵过程,结果表明,系统中的细菌和古菌类群具有很高的多样性,细菌类群的数量高于古菌类群。对原核生物的动态变化进行聚类分析,发现整个发酵过程中细菌和古菌的群落结构不断在变化；细菌类群的丰度变化明显大于古菌类群。整个发酵过程中细菌和古菌的群落结构变化规律可以分为3个阶段,但细菌类群的变化阶段明显早与古菌类群的变化。4. Illumina高通量测序结果表明,模拟沼气发酵过程中涉及的原核生物类群主要归属于19个门一级的系统发育类群：泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、Synergistetes、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、绿菌门(Chlorobi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Armatimonadetes、Caldithrix、 Lentisphaerae、热袍菌门(Thermotogae)和OP9、OP11等。广古菌门(Euryarchaeota)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)同样是沼气发酵系统中的主要优势类群。在模拟沼气发酵过程中,沼气发酵系统的原核生物变化规律同样分为3个阶段,不同类群的原核生物变化趋势不一致。广古菌门(Euryarchaeota)在发酵过程中的丰度变化趋势为增加,相对丰度由发酵初期的32.4%到发酵末期的60.5%。厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度由发酵初期的19.2%到发酵末期的6.4%,与广古菌门(Euryarchaeota)的变化趋势相反。拟杆菌门(Bacteroidetes),相对丰度由发酵初期的15.7%到发酵末期的5.9%,变化趋势同样是减少。一些细菌类群的相对丰度变化与产气量变化相一致,与产气量存在一定的相关性。5.云南不同气候类型与地理区域的农村户用沼气发酵系统中,原核生物的群落分布与环境因子(发酵条件)存在着显著的相关性。RDA分析结果显示,沼气发酵系统中的总固体(TS)和化学需氧量(COD)是影响细菌类群地理空间分布的最主要非生物因子,而温度是影响古菌属群落分布的主要环境因子。而在模拟沼气发酵过程中,TS和COD同样是影响沼气发酵细菌类群时间动态变化的主要非生物因子;恒温条件下,主要产甲烷古菌类群受到发酵条件的影响不大。