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背景:干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF-3)是干扰素调节因子家族中的一员,主要负责诱导I型干扰素(interferon,IFN)、干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)和促炎性细胞因子的生成,在固有免疫中发挥了重要的作用。然而最近的研究发现,IRF-3不仅参与人体的固有免疫,它在癌症中的异常表达也给癌症研究带来新的思路,但是目前对IRF-3在肺癌中的转录调节机制了解甚微。早期发现转录因子GATA-1可以促进血红细胞的分化成熟,在胚胎的造血功能中发挥重要作用。GATA-1在红细胞、巨核细胞、肥大细胞和中性粒细胞中活化或者抑制基因的转录。GATA-1蛋白有两个高度保守的锌指结构域。其位于C端的锌指结构域能够介导GATA-1与基因WGATAR序列相结合,该结构域的乙酰化水平能够受到组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)和转录辅助激活因子p300的调控,从而改变GATA-1的转录特性,影响它对下游靶基因启动子的结合。目的:探索人肺腺癌和癌旁正常肺组织中IRF-3和GATA-1的异常表达,分析IRF-3基因启动子的核心启动子区域,找出调节IRF-3表达的关键转录因子以及该转录因子与IRF-3在肺腺癌细胞中的所起的作用。探索肺腺癌细胞中HDACi对IRF-3启动子的调节机制,探讨IRF-3在HDACI辅助治疗肺腺癌中发挥的作用。方法:1、利用在线生物信息学软件TFSEARCH和Matlnspector对IRF-3基因启动子转录起始位点-149 bp～+18 bp的DNA片段的转录因子结合位点进行预测,同时再利用Primer 5.0设计软件,根据生物信息学的预测结果设计IRF-3启动子上GATA-1结合位点的碱基缺失突变的引物,在现有的IRF-3核心启动子萤光素酶报告基因质粒pGL3-149上进行GATA-1结合位点的缺失突变,并检测其在A549细胞中萤光素酶的活性。2、ChIP染色质免疫共沉淀和EMSA凝胶迁移实验,从分子水平上验证在肺腺癌A549细胞中转录因子GATA-1与IRF-3启动子的体内和体外的结合以及在TSA刺激下两者结合程度的变化。3、利用Oncomine数据库的现有大数据结果,分析IRF-3和GATA-1在肺腺癌相对于癌旁正常肺组织的表达,以及其IRF-3与GATA-1表达量的相互关系。4、利用Q-pcr和Western Blot实验检测肺癌标本中IRF-3和GATA-1蛋白的表达。5、小干扰RNA和转录因子过表达实验检测GATA-1对IRF-3的转录调控。6、TSA刺激A549细胞,检测IRF-3的启动子萤光素酶活性、信使RNA(messenger ribonucleic acid,mRNA)和蛋白的表达量,以及在TSA刺激下GATA-1结合位点缺失前后的IRF-3启动子萤光素酶活性的改变。7、利用免疫荧光的方法定位GATA-1在肺腺癌A549细胞核内的表达。8、利用免疫沉淀的方法验证GATA-1在TSA的刺激下乙酰化表达量的改变,用ChIP-qPCR的方法检测乙酰化GATA-1与IRF-3启动子结合程度的改变。9、过表达p300,观察HAT对IRF-3启动子活性以及mRNA表达的影响,分析p300与GATA-1的结合在启动子上的位置关系。结果:1、通过生物信息学的分析可知人IRF-3启动子的核心区域位于-67bp至-149bp之间(转录起始位点设为+1);转录因子GATA-1、HSF、CdxA和E2F1可能通过与该核心启动子区域调节人IRF-3的基因转录。缺失突变GATA-1在IRF-3启动子结合位点上的多个关键碱基对后,发现IRF-3启动子萤光素酶活性依赖于GATA-1的结合位点。2、利用ChIP和EMSA技术证实,在A549细胞中,GATA-1通过体内和体外途径可以结合在IRF-3核心启动子上。3、Oncomine数据库的大数据统计结果,分析出肺腺癌病人样本中的IRF-3的mRNA表达相对于癌旁正常肺组织显著升高,而GATA-1 mRNA的表达相对于癌旁正常肺组织则显著降低或者发生突变,这与我们获得的肺腺癌组织和癌旁正常肺组织中IRF-3和GATA-1蛋白量的表达趋势一致。4、siRNA敲低细胞内GATA-1和GATA-1过表达的研究证实了在肺腺癌细胞系A549细胞中GATA-1对IRF-3的转录调控具有负调节作用。5、TSA和VPA上调IRF-3启动子的活性和mRNA的表达。6、缺失突变GATA-1在IRF-3启动子上的结合位点后,TSA不能上调IRF-3启动子的活性。7、免疫荧光的方法检测到GATA-1在细胞核中表达。8、ChIP-qPCR和免疫沉淀实验证明,TSA刺激GATA-1发生乙酰化后加强了与IRF-3启动子的结合。9、TSA还可以刺激p300与GATA-1共结合在1RF-3的启动子上,增强IRF-3启动子的活性。结论:1、Oncomine数据库和实验表明IRF-3和GATA-1在肺腺癌中的表达呈负相关,IRF-3的上调可能与肺腺癌的发病有关。2、人IRF-3基因的核心启动子区域位于-67至-149bp之间,GATA-1能通过与该区域在体内和体外的结合调节IRF-3的启动子活性,并且下调IRF-3的mRNA转录和蛋白的表达。3、TSA和VPA上调IRF-3的启动子活性,并且这种上调效果依赖于GATA-1在IRF-3启动子上的结合。4、TSA可以乙酰化GATA-1,乙酰化的GATA-1与IRF-3启动子的结合增强。