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目的:本研究的目的是在观察脓毒症相关性脑病(Sepsis-associated Encephalopathy,SAE)线粒体损伤的基础上,探讨亚甲蓝(Methylene Blue,MB)通过AMPK/PGC-1α通路对SAE脑能量代谢的调控作用。主要研究包括:1)制备脓毒症相关性脑病的细胞实验模型,观察线粒体损伤,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平、细胞凋亡等;2)探讨MB在SAE细胞模型中对AMPK/PGC-1α通路的激活以及能量调控;3)建立Wistar大鼠脓毒症模型,探讨亚甲蓝在SAE动物模型中对SAE Wistar大鼠的AMPK/PGC-1α通路的激活以及能量调控。方法:1)应用细胞原代培养技术分离纯化Wistar大鼠乳鼠(出生3天以内)的大脑皮质星形胶质细胞,进行纯度鉴定后,以不同浓度的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和20 ng/mL的干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)联合孵育,依照孵育时间(6h,12h,24h,48h)以及脂多糖的浓度(50 ng/mL,100 ng/mL,200 ng/mL)制备脓毒症相关性脑病的细胞实验模型,通过对比细胞活力,肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素-6(IL-6),一氧化氮(NO),活性氧(ROS),星形胶质细胞形态的改变,确认模型成功制备。通过观察细胞凋亡比、线粒体网格形态、线粒体膜电位观察SAE细胞模型下的星形胶质细胞的线粒体损伤。通过Western blot实验观察线粒体生物发生以及线粒体动力学相关指标的变化,包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)、核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor-1,NRF1)、视神经萎缩l基因蛋白(optic atrophy l gene protein,OPA1)、动力相关蛋白1(dynamin-related protein,DRP1),测定能量指标ATP,观察细胞凋亡;2)在第一部分研究基础之上,以100ng/mL的LPS联合20 ng/mL的IFN-γ分别孵育原代培养的星形胶质细胞6h和48h,模拟SAE细胞模型的早期和晚期SAE疾病环境。对上述SAE细胞模型均分别给予MB(0.01 nmol/mL)和MB(0.01nmol/mL)+Compound C(10nmol/mL)6h干预。分别探讨MB在SAE细胞模型的早期和晚期对AMPK/PGC-1α通路激活的分子机制,以及在细胞研究水平上观察MB对线粒体生物发生相关指标,包括PGC-1α,TFAM,NRF1,能量指标ATP、细胞凋亡、ROS的影响;3)选用成年雌性,体重180-200g左右的Wistar大鼠,行盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)术制备脓毒症动物实验模型。CLP术后24h后根据脑电图出现广泛而较为持久的θ波以及神经行为学评分确认为SAE模型。对SAE组动物随机给予亚甲蓝(0.15mg/100g)腹腔注射,6h后处理各组动物,采集血清,提取大鼠大脑皮质蛋白。通过Western blot实验观察SAE大鼠大脑皮质组织的线粒体生物发生相关蛋白水平,凋亡指标,ATP的变化;探讨亚甲蓝腹腔注射对SAE大鼠的大脑皮质组织AMPK/PGC-1α通路的调控、对大脑皮质组织ATP含量及凋亡的影响。结果:1)用LPS和IFN-γ联合孵育原代培养的星形胶质细胞,制备SAE的体外实验模型,和control对比,SAE细胞活力下降,IL-6、TNF-α、ROS和NO增高,SAE模型的星形胶质细胞胞体变大,突起变粗,确认成功制备模型;2)观察SAE细胞实验模型,发现星形胶质细胞的线粒体生物发生相关蛋白水平(PGC-1α,TFAM,NRF1),线粒体融合及分裂相关蛋白水平(OPA1和DRP1)在LPS和IFN-γ联合孵育6h,随着LPS浓度的增加,表达逐渐上升,联合孵育12h,上述指标随着LPS浓度的增加表现为先上升后下降,在联合孵育24h及48h,上述指标随着LPS的浓度的增加,表现下降趋势,细胞内ATP含量呈现较为接近的变化趋势;3)在SAE细胞实验模型里,和对照组对比,MB在6h及48h组都增加了p-AMPK表达,增强了细胞线粒体生物发生,增加了细胞内ATP含量,在6h组,凋亡比下降,在48h组,未见凋亡比下降;4)在SAE动物实验模型,发现CLP术后24h,和sham组及CLP组对比,SAE组和SAE+MB组的神经行为学评分下降,血清S100β、GFAP、NSE升高,MB增加了SAE大鼠大脑皮质组织p-AMPK表达,增强了线粒体生物发生蛋白表达,增加细胞内ATP含量,改善凋亡。结论:原代培养的星形胶质细胞的线粒体生物发生以及细胞ATP水平在SAE体外实验模型早期增强,晚期减弱;在细胞水平和组织水平的研究,均发现MB可以通过激活AMPK/PGC-1α通路增强线粒体生物发生,改善SAE细胞能量水平及细胞凋亡。