随着后基因组时代的来临,家蚕作为鳞翅目模式昆虫已渐渐成为基因功能研究的理想遗传资源。目前,家蚕基因组精细图的完成更是为家蚕功能基因组研究提供了丰富的信息。醛氧化酶(AO,EC 1.2.3.1)是一类能催化醛类氧化成羧酸并释放出活性氧的蛋白酶,它属于钼-黄素酶(MFE)家族,具有该家族保守的功能域。AO广泛地存在于动植物体内,是有着众多生理生化功能的重要酶类。它属于多基因家族,不同的AO亚型执行着不同的生理功能。已有的研究表明,它在植物中参与催化吲哚乙酸与脱落酸的生物合成反应;在哺乳动物中,参与代谢产物和外源物的氧化降解、视黄酸合成、药物代谢及肝脏中有毒化合物代谢,还与一些人类疾病的病理相关,其活性水平已成为医学上临床用药及治疗效果评估的一个重要参数;另外,AO在昆虫嗅觉的气味分子降解过程中也起着至关重要的作用,且与昆虫抗药性相关。但是,作为一种重要的代谢酶类,醛氧化酶在遗传、进化及生理生化功能等方面的信息还相当匮乏。本研究利用家蚕全基因组数据,对家蚕醛氧化酶基因(BmAOX)家族进行了鉴定和生物信息学分析,采用RT-PCR、基因克隆、Native-PAGE、组织原位杂交等技术对BmAOX的结构、转录水平和蛋白水平的表达特征进行了分析,同时对其中两个组织特异表达的BmAOX家族成员作了功能初探。主要研究结果如下:1.家蚕醛氧化酶基因(BmAOX)的鉴定及生物信息学分析基于序列的相似性及功能域的保守性,我们在家蚕基因组中对醛氧化酶基因家族作了生物信息学分析,成功找到了8个BmAOX候选基因,分别命名为BmAOX1、BmAOX2、BmAOX3、BmAOX4、BmAOX5、BmAOX6、BmAOX7、BmAOX8。它们位于家蚕第18号染色体上,预测序列含12～20个外显子,编码阅读框长3201～3831bp,预测蛋白含1073～1276个氨基酸残基,分子量大小为118.5～141.8kDa,等电点为5.18～7.57。蛋白结构分析发现,这8个BmAOX均具有醛氧化酶保守的功能域。进化分析表明,它们与昆虫AO基因聚为一簇。2.BmAOX在转录水平及蛋白水平的表达特征通过RT-PCR和组织蛋白Native-PAGE的AO活性染色方法,对已鉴定出来的8个家蚕醛氧化酶候选基因在转录水平和蛋白水平的表达特征做了分析。结果显示:BmAOX1、BmAOX2仅在蚕蛾触角中表达,BmAOX3仅在蚕蛹生殖腺表达,BmAOX5仅在雌蛾的性信息腺表达,这四个基因具有很强的组织特异性。其中BmAOX1、BmAOX2的表达特征与已有的报道一致;BmAOX6在蛹中不表达,而在蛾的触角、胸、腹、翅等多个组织均有表达,具有时期特异性。另外,BmAOX4、BmAOX7、BmAOX8在蛹和蛾的多个组织均有表达,说明它们在家蚕生理代谢活动中起着重要的作用。在蛋白水平上,我们检测到家蚕蛹中有5种有活性的醛氧化酶,而蚕蛾中有6种,各组织中均有有活性的BmAOX,只是种类和活性有所不同。3.生殖腺特异表达的BmAOX3的克隆及表达特征分析对家蚕生殖腺特异表达的BmAOX3基因进行了编码序列的克隆,获得了全长为3537bp的完整ORF,编码的蛋白含1178个氨基酸,分子量大小为132.7kDa,等电点为8.06。BmAOX3的多序列比对结果显示,它具有醛氧化酶高度保守区域,进一步证明了它属于钼黄素酶家族的醛氧化酶亚家族。BmAOX3在5龄末期和蛹末期的卵巢中高量表达,且随家蚕发育时期呈周期性变化,到蛾期停止表达。而不同时期卵巢的醛氧化酶蛋白活性检测结果显示:以蛹3天为界,在此之后的卵巢中,醛氧化酶不论从活性还是种类上均大大增加。初步推测:在这个卵巢处于新陈代谢旺盛的发育阶段,BmAOX3可能参与其中某一个或几个生理代谢途径,从而在卵巢的发育及卵的形成过程中起作用。4.性信息腺特异表达的BmAOX5的克隆及表达特征分析本研究克隆了雌蛾性信息腺特异表达的BmAOX5的编码序列,获得的完整ORF全长为3737bp,编码含1245个氨基酸的蛋白,分子量大小为137.9kDa,等电点为5.54。通过氨基酸序列的多序列比对,证实BmAOX5具有作为醛氧化酶家族成员所特有的高度保守的功能域。对不同时期雌蛾性信息腺作BmAOX5的时期表达谱,发现该基因在蛾繁殖时期有高量表达。同样在蛋白活性检测中也发现了明显的醛氧化酶活性带。以BmAOX5 RNA为探针进行组织原位杂交,结果显示该基因在性信息腺囊壁和产卵管内壁表达。推测BmAOX5与降解性信息素、调节性信息素浓度有关;同时该基因可能还参与一般环境气味分子的代谢,在家蚕生殖活动和产卵场所的选择中起重要作用。综上所述,本研究基于家蚕全基因组数据,对家蚕醛氧化酶基因家族进行了较为完整的鉴定分析,找到了8个BmAOX候选基因。从这8个BmAOX在转录水平和蛋白水平的表达特征看,其中多个基因都在各组织有表达,说明它们在家蚕生理代谢活动中起着重要的作用。同时找到了在生殖腺特异表达的BmAOX3和在雌性信息腺特异表达的BmAOX5。通过分析BmAOX3的序列及表达特征,初步认为BmAOX3可能参与卵巢的发育及卵的形成。通过BmAOX5的克隆、时期表达谱及组织定位分析,推测该基因与性信息素及一般环境气味的降解代谢有关,在家蚕生殖活动中起关键作用。